实验一-核酸的提取学习资料

分子生物学实验(shíyàn)

Experimentsofmolecularbiology授课(shòukè)教师：田生礼实验一核酸(hésuān)的提取第一页，共28页。实验一核酸(hésuān)的提取

（质粒DNA的提取和纯化）【目的要求】1．学习载体的基本结构2．了解碱裂解法质粒提取过程中各步骤的设计(shèjì)思想；3．掌握碱裂解法提取质粒的原理方法和各项基本技术；第二页，共28页。【实验(shíyàn)原理】碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全(wánquán)分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。第三页，共28页。【实验材料和用品】恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅、Enpendorf管、含有目的基因(jīyīn)pADH的PMD-20T质粒的大肠杆菌、碱裂解溶液，酚、氯仿、乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶。注：pADH为多头绒泡菌乙醇脱氢酶第四页，共28页。【实验步骤】1、取1.5ml培养液倒入1.5mleppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。

2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。

3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。

4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl,盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。

5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g离心5-10分钟。

6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4℃下12000g离心5分钟。

7、将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。

8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有(suǒyǒu)液体流出,加入1ml70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g离心5-10分钟。

9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。

10、将沉淀溶于20μlTE缓冲液(pH8.0，含20μg/mlRNaseA)中，37℃金属浴一个小时，然后储于-20℃冰箱中。第五页，共28页。质粒电泳图第六页，共28页。核酸的分离(fēnlí)与纯化不论是基因工程还是蛋白质工程，核酸分子是这些技术应用所涉及的主要对象，所以核酸的分离(fēnlí)与提取是生化与分子生物学研究中非常重要的基本技术。核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。第七页，共28页。核酸的种类(zhǒnglèi)：真核生物的染色体DNA为双链线性分子；真核细胞器DNA为双链环状分子；原核生物的基因组DNA、质粒DNA为双链环状分子；RNA分子在大多数生物体内均是单链线性分子；不同类型的RNA分子可具有不同的结构特点，如真核mRNA分子多数在3’端带有ploy(A)结构;tRNA的三叶草结构。病毒的DNA、RNA，其存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线状和单链线状等。第八页，共28页。一、核酸分离(fēnlí)提取的原则分离纯化(chúnhuà)核酸总的原则①应保证核酸一级结构的完整性；②排除其它分子的污染，保证较高纯度。第九页，共28页。3.为了保征分离核酸的完整性和纯度，在实验过程中，应注意以下事宜：①尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏(pòhuài)；②减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏(pòhuài)，操作多在pH4-10条件下进行；第十页，共28页。③减少物理因素对核酸的破坏，物理破坏因素主要是机械剪切力，其次是高温。④防止核酸的生物降解，细胞(xìbāo)内或外界的各种核酸酶（DNA酶、RNA酶）酶解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。第十一页，共28页。其中(qízhōng)DNA酶，需要金属二价离子Mg2+，Ca2+的激活，使用金属二价离子螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸盐，基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNA酶，不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。第十二页，共28页。提取高质量基因组DNA的主要用途：PCR扩增的模板(múbǎn)用于构建基因组文库用于Southernblot杂交分析二、真核细胞染色体DNA的制备(zhìbèi)第十三页，共28页。1.真核细胞的破碎（1）物理方式:超声波法、匀浆(yúnjiānɡ)法、液氮破碎法、Al2O3粉研磨法等。这些物理操作均可导致DNA链的断裂。（2）为了获得大分子量的DNA，一般采用蛋白酶K和去污剂温和处理法。真核细胞染色体DNA的制备(zhìbèi)过程第十四页，共28页。2.去除蛋白质常用酚、氯仿抽提。反复的抽提操作对DNA链的机械剪切机会较多，所以有人使用高浓度甲酰胺解聚核蛋白联合透析的方法，可以获得200kb以上的DNA片段，适用于粘粒(cosmid)构建基因组文库。根据(gēnjù)不同的实验要求，可选择不同的实验方法制备真核细胞染色体DNA。第十五页，共28页。3.DNA沉淀：一般(yībān)采用2倍体积乙醇沉淀或用异丙醇（0.6）4.DNA溶解：一般(yībān)采用TE第十六页，共28页。从细胞中分离RNA的纯度与完整性对于许多分子生物学实验至关重要。如Northernblot及cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上决定(juédìng)于RNA的质量。三、RNA的分离(fēnlí)与纯化-真核细胞RNA的制备第十七页，共28页。RNA主要由以下几类分子组成：rRNA(占RNA总量的80％—85％)、tRNA和核内小分子RNA(占10％-15％)、mRNA(占1％～5％)。rRNA在总RNA分子中含量最丰富，由28S、18S、5S及4S几类组成，它们之间同源性大，分子量变化不大，所以可根据它们的密度(mìdù)和分子大小，通过密度(mìdù)梯度离心，凝胶电泳或离子交换层析进行分离。第十八页，共28页。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子(除血红蛋白及有些组蛋白mRNA以外)，均在3’端存在20-250个多聚腺核苷酸poly(A)。利用(lìyòng)此特征，可很方便地从总RNA中，用寡聚(dT)亲和层析柱分离mRNA。mRNA分子群体编码细胞内所有的多肽和蛋白质，而mRNA是分子生物学的主要研究对象之一。第十九页，共28页。鉴定所提取总RNA分子(fēnzǐ)的质量，可以通过琼脂糖电泳后观察是否有明显得28S、18S条带来判断。第二十页，共28页。Fig.1TotalRNAisolatedfromTrichodermareeseiinducedbydifferentinducers图1.木霉总RNA的分离1.微晶(wēijīnɡ)纤维素2.天然稻草粉第二十一页，共28页。如何创造一个(yīɡè)无RNase的环境？RNA分离的关键因素是：尽量减少RNA酶的污染！极力避免外源RNase的污染：主要来源于操作者的手、实验的器皿和试剂尽力抑制内源性RNase的活力：主要来源于样品中的组织细胞。第二十二页，共28页。怎样去除外源性RNase的污染？(1)操作者的手直接触摸之处，毫无疑问会留下RNase，说话带出的唾液也富含RNase。故整个操作过程中，应戴口罩和手套。(2)空气中飞尘(fēichén)携带的细菌、霉菌等微生物，也是污染外源RNase的一条途径，所以操作过程应在比较洁净的环境中进行。第二十三页，共28页。(3)玻璃器经过常规洗净后，应用0.1％焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)浸泡处理(37℃，2小时)，再用双蒸灭菌水漂洗几次。高压消毒去除DEPC，然后200℃烘烤4小时以上或180℃烘烤过夜。(4)塑料器材最好(zuìhǎo)使用灭菌的一次性塑料用品，Eppendorf管、微量加样吸头最好(zuìhǎo)是新的，使用前进行高压蒸汽消毒。第二十四页，共28页。如何抑制内源性RNase的活性？要尽可能早地去除细胞内蛋白，加入RNase抑制剂，力争(lìzhēng)在提取的起始阶段对RNase活力进行有效地抑制。

第二十五页，共28页。RNase抑制物：（1）低特异性RNase抑制物：不同类型的低特异性RNase抑制物均可不同程度地抑制Raise的活性，其中包括(bāokuò)DEPC皂土(bentonite):Al2O3·4SiO2·H2O复合硅酸盐(Macaloid)肝素氧钒基—核苷复合物多胺第二十六页，共28页。（2）去除蛋白质的物质：蛋白质变性剂：酚、氯仿；尿素蛋白酶K去污剂：SDS、十二烷酰肌氨酸钠(sarkosyl)、脱氧胆酸钠(DOC)是阴离子去污剂解偶剂(胍类)：盐酸胍、异硫氰酸胍是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级