表观遗传学研究

表观遗传学研究表观遗传

表观遗传（epigenetics）是指DNA序列不发生变化，但基因表达却发生了可遗传的改变。这种改变是细胞内除了遗传信息以外的其他可遗传物质发生的改变，且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递。人类基因组含有两类信息基因组DNA的碱基排列顺序，它提供生命所必需的所有蛋白质合成的蓝图；表观遗传（epigenetic）信息，知道基因在何时、何地表达和关闭。Onegenome--------multipleepigenome表观遗传的特点

1.没有DNA序列的改变2.可遗传的,即这类改变通过有丝分裂或减数分裂，能在细胞或个体世代间遗传；3.可逆性的基因表达调节表观遗传学研究DNA甲基化组蛋白修饰染色质重塑基因组印迹X染色体失活DNA甲基化

DNA甲基化(DNAmethylation)是研究得最清楚、也是最重要的表观遗传修饰形式，主要是基因组DNA上的胞嘧啶第5位碳原子和甲基间的共价结合，胞嘧啶由此被修饰为5甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)。DNMT1SAM胞嘧啶5-甲基胞嘧啶胞嘧甲基化反应

S-腺苷甲硫氨酸DNA甲基化哺乳动物基因组中5mC占胞嘧啶总量的2%-7%，约70%的5mC存在于CpG二连核苷。在结构基因的5’端调控区域,

CpG二连核苷常常以成簇串联形式排列，这种富含CpG二连核苷的区域称为CpG岛(CpG

islands)，其大小为500-1000bp，约56%的编码基因含该结构。基因调控元件(如启动子)所含CpG岛中的5mC会阻碍转录因子复合体与DNA的结合。DNA甲基化一般与基因沉默相关联；非甲基化一般与基因的活化相关联；而去甲基化往往与一个沉默基因的重新激活相关联。重亚硫酸盐测序图5重亚硫酸盐测序原理DNA甲基化的检测2.组蛋白修饰

组蛋白修饰是表观遗传研究的重要内容。组蛋白的N端会受到不同的化学修饰，这种修饰往往与基因的表达调控密切相关。被组蛋白覆盖的基因如果要表达，首先要改变组蛋白的修饰状态，使其与DNA的结合由紧变松，这样靶基因才能与转录复合物相互作用。因此，组蛋白是重要的染色体结构维持单元和基因表达的负控制因子。2.1组蛋白修饰种类

乙酰化--一般与活化的染色质构型相关联，乙酰化修饰大多发生在H3、H4的Lys残基上。甲基化--发生在H3、H4的Lys和Asp残基上，可以与基因抑制有关，也可以与基因的激活相关，这往往取决于被修饰的位置和程度。磷酸化--发生与Ser残基，一般与基因活化相关。泛素化--一般是C端Lys修饰，启动基因表达。SUMO（一种类泛素蛋白）化--可稳定异染色质。2.2组蛋白修饰位点：

通常发生在蛋白质的赖氨酸(K)上；可逆的生化反应：乙酰化和去乙酰化分子效应：

中和赖氨酸上的正电荷，增加组蛋白与DNA的排斥力，使DNA结构变得疏松，从而导致基因的转录活化。生物学功能：

A.基因转录活化；B.DNA损伤修复2.2组蛋白的乙酰化2.3组蛋白的甲基化位点：主要发生在赖氨酸(K)或精氨酸(R)上；分子效应：增加赖氨酸上的疏水力生物学功能：

A.基因转录活化（H3-K4)；B.基因转录沉默（H3-K9）；C.X染色体失活2.4组蛋白的磷酸化位点：主要发生在丝氨酸(S)/苏氨酸(T)功能：A.转录调控：H3K10被Rsk-2磷酸化B.异染色质的形成：H4S1的磷酸化C.DNArepair：H2AX磷酸化如何研究组蛋白与DNA的相互作用

染色质免疫沉淀技术（chromatinimmunoprecipitationassay,CHIP）染色质免疫沉淀技术（chromatinimmunoprecipitationassay,CHIP）研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法，在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰。基本原理：在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选。甲醛处理细胞染色质免疫沉淀技术（chromatinimmunoprecipitationassay,CHIP）3、染色质重塑

染色质重塑（chromatinremodeling）是一个重要的表观遗传学机制。染色质重塑是由染色质重塑复合物介导的一系列以染色质上核小体变化为基本特征的生物学过程。组蛋白尾巴的化学修饰（乙酰化、甲基化及磷酸化等）可以改变染色质结构，从而影响邻近基因的活性。4.基因组印迹(genomicimprinting)

依赖于父、母源性的等位基因的差异性表达，即父亲和母亲的基因组在个体发育中有着不同的影响，这种现象称基因组印迹。

两个亲本的等位基因差异性甲基化是基因组印迹现象的基础。5.X染色体失活1961年就提出了关于雌性哺乳动物体细胞的两条X染色体中会有一条发生随机失活的假说，并认为这是一种基因剂量补偿的机制，哺乳动物雌性个体的X染色体失活遵循n-1法则，不论有多少条X染色体，最终只能随机保留一条的活性。X染色体失活过程为：Xist基因编码XistRNA，XistRNA包裹在合成它的X染色体上，引发X染色体失活；随着XistRNA在X染色体上的扩展，DNA甲基化和组蛋白的修饰马上发生，这对X染色体失活的建立和维持有重要的作用。Prader-Willisyndrome,PWS（父源）：肥胖、矮小,中度智力低下Angelmansyndrome,AS（母源）：共济失调,严重智力低下疾病的基础：15q11-13微缺失两个亲本等位基因的差异性甲基化的结果H2AZH2AZ是组蛋白H2A家族中的一员

组蛋白H2A家族包括H2A1、H2A2、H2AZ和H2AX。

Polycombgroup(PcG)proteins：是一类转录抑制因子，通过对染色质结构的表观遗传学修饰调控与发育相关基因的表达。染色质的结构受一系列复杂的过程调控，但对调控的过程和机理不清楚的地方。染色质的调控包括：核小体的重调、组蛋白的修饰、特异的组蛋白亚型替换常见的组蛋白。各种亚型的组蛋白是染色质的结构成分，影响一系列DNA相关的生物学过程：如基因组的完整性、X染色体失活、DNA的修复、基因表达调控。

H2AZ蛋白的功能H2AZ在多细胞生物中非常重要，参与从线虫到人的各个物种的与DNA有关的生物学过程，包括基因表达调控。H2AZ与基因的激活和抑制都相关，H2AZ在很多物种中，与基因组DNA中的转录起始位点两侧的一小段DNA结合。

研究表明H2AZ可以影响邻近组蛋白的修饰模式、染色质结构重调酶的活性、染色质的构象。H2AZ在ES细胞中结合位点的分析通过ChIP和基因芯片的分析发现，在ES细胞中H2AZ与大量发育相关基因的转录起始位点两侧的DNA结合，这种结合模式与Suz12相似（Suz12是Polycombgroup（PcG）proteins家族中的成员）。全基因组的分析发现，H2AZ蛋白与1655个蛋白质编码基因的启动子区域结合。H2AZ在ES细胞中结合位点的分析H2AZ结合基因的分类H2AZ与发育相关的基因结合H2AZ、SUZ12与DNA结合情况的比较H2AZ、SUZ12与DNA结合情况的比较H2AZ、SUZ12与HOX基因家族DNA序列的结合比较H2AZ、和SUZ12与1655个基因结合模式的比较H2AZ在神经前体细胞和ES细胞中与DNA的结合比较H2AZ蛋白在基因组中的空间分布RNAi干扰敲除ES细胞中的H2AZ基因

人工合成的19bp的双链RNA，降解H2AZmRNA，从而降低ES细胞中H2AZ蛋白的含量,最终达到敲除H2AZ基因的目的。H2AZ#1(5-TGGAGATGAAGAATTGGAT-3)H2AZ#2(5-GGTAAGGCTGGAAAGGACT-3)RNA干扰（RNAinterference,RNAi）由双链RNA（double-strandedRNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。RNA干扰的发现获得2006年的诺贝尔生理医学奖RNAi干扰的发现

1995年，康乃尔大学的中国留学生SuGuo博士在试图阻断线虫（C.elegans）中的par-1基因时，发现了一个意想不到的现象。她们本是利用反义RNA技术特异性地阻断上述基因的表达，而同时在对照实验中给线虫注射正义RNA（senseRNA）以期观察到基因表达的增强。但得到的结果是二者都同样地切断了par-1基因的表达。这是与传统上反义RNA技术不能解释这一现象，该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。

直到1998年2月，AndrewFire和CraigMello才首次揭开这个悬疑之谜。他们证实，SuGuo博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。该小组将这一现象称为RNA干扰（RNAinterference,简称RNAi）。

反义RNA技术反义RNA:与mRNA互补的RNA分子正义RNA:内源mRNA序列相对应的RNAH2AZ对ES细胞的自我更新和多潜能性的维持是非必需的siRNAOct4是维持ES细胞多能性的基因H2AZ控制靶基因的表达H2AZ敲除的ES细胞中，H2AZ靶基因的表达水平。对照组：正常的ES细胞Enriched:富集H2AZ的靶基因与suz12类似（ES细胞敲除Suz12基因）RT－PCRH2AZ、Suz12与靶基因启动子的结合是相互依赖的H2AZ#1siRNA敲除H2AZ基因的ES细胞Suz12-/-:敲除Suz12基因的ES细胞H2AZ对ES细胞的分化的关系诱导ES细胞早期分化的标志基因：Pax3Wnt3A,Brachyury

Oct4,Nanog是维持ES细胞全能性的关键基因retinoicacidH2AZ对ES细胞的分化的关系Retinoicacid（RA,视黄酸）

Nestin和Sox1是早期神经细胞特异表达的基因。总结1.通过Chip实验分析了H2AZ蛋白在ES中细胞中与基因组DNA的结合情况。2.H2AZ蛋白与一系列发育相关基因的启动子结合，这种结合情况与Polycombgroup(PcG)蛋白家族成员Suz12类似。3.通过RNAi在ES细胞中敲除H2AZ基因后，ES细胞的更新（拟胚体