第22章免疫学检测技术的基本原理

第22章免疫学检测原理免疫学检测是指借助免疫学、细胞生物学、分子生物学等理论或方法，对抗原、抗体、免疫细胞及细胞因子等进行定性、定量检测。临床医学中，免疫学检测可用于免疫相关疾病的诊断、病情检测和疗效评价等。第一节基于抗原-抗体反应的检测方法第二节免疫细胞检测第三节分子生物学技术在免疫学上的应用本章内容第一节基于抗原-抗体反应的检测方法一、抗原抗体反应概念抗原与相应抗体在体内、外发生的高度特异性结合反应。在合适条件下所进行的体外反应中，抗原与相应抗体特异性结合可呈现某种反应现象（如凝集、沉淀）。由于实验所用抗体存在于血清中，故又称血清学反应。二、抗原抗体反应的特点高度特异性可精确区分物质间极微细的差异。表示为亲和力：一个抗原表位与相应抗体单一抗原结合位点间的结合能力。亲合力：指一个抗体分子与整个抗原大分子间的结合强度，与抗原表位数目有关。2.抗原抗体结合的带现象与可见性抗原抗体结合存在带现象（前带、等带、后带），适宜的抗原抗体浓度和比例（等带）决定抗原抗体结合后能否出现肉眼可见的反应；3.表面化学基团之间的可逆结合抗原抗体结合除了空间结构互补外，主要以氢键、范德华力和疏水键等非共价结合。易受温度、酸碱度和离子强度的影响而解离，解离后抗原抗体仍具有原有特性，可借助亲和层析法纯化抗原或抗体。抗原抗体反应的2个阶段第1阶段是抗原抗体特异性结合，可在数秒钟至几分钟内完成；第2阶段是小的抗原抗体复合物靠正负电荷吸引形成较大复合物，所需时间从数分钟至数日不等。三、抗原抗体反应的影响因素电解质抗原抗体等电点分别为pH3-5和pH5-6，在中性或弱碱性条件下表面带有较多负电荷，适当浓度的电解质会使它们失去一部分负电荷而相互结合；温度通常为37℃，适当提高反应温度可增加抗原与抗体分子的碰撞机会，但56℃以上可使抗原或抗体变性失活；酸碱度抗原抗体反应的最适pH值在6-8之间，pH值过高或过低均可直接影响抗原抗体的理化性质。当pH值接近等电点时，抗原抗体多带正负电荷相等，由于自身吸引而出现凝集，导致非特异性反应。四、抗原抗体反应检测技术的应用抗原与相应抗体在体内、外发生的高度特异性结合反应。在合适条件下所进行的体外反应中，抗原与相应抗体特异性结合可呈现某种反应现象（如凝集、沉淀）。由于实验所用抗体存在于血清中，故又称血清学反应。五、抗原-抗体反应的基本检测方法AbAg高亲和力AbAg低亲和力特异性结合力的表示方法亲和力和亲合力低亲合力高亲合力Ag-Ab反应的原理Ab过剩Ag过剩比例适当，交联成网络Ag-Ab反应的可见性1.凝集反应直接凝集反应1:2稀释待测血清1:41:81:16细菌、细胞等颗粒性Ag或表面包被抗原的颗粒状物质与相应Ab在电解质存在的情况下直接反应，二者比例合适时，出现肉眼可见的凝集团现象。玻片法试管法常用于菌种鉴定或ABO血型鉴定选择最佳稀释浓度，常用于检测抗体的滴度或效价，见于临床诊断伤寒或副伤寒所用的肥达氏反应和诊断布氏菌病所用的瑞特试验。间接凝集反应将可溶性Ag/Ab先吸附在某些颗粒载体上，形成致敏颗粒，然后再与相应Ab/Ag进行反应产生凝集，叫间接凝集反应。如将溶血毒素O吸附于乳胶颗粒上的抗“O”试验、人IgG作为Ag吸附于乳胶颗粒上的类风湿因子检测。凝集反应常用于溶血性疾病的诊断：+YYYYYYYYYYYY病人的RBC体内anti-Rh由于抗体多属于IgG，分子量较小，抗体与红细胞间的结合力不能克服细胞间的排斥力，不出现凝集+YYYYYYYYYYYYYYY体外加入抗人IgG出现凝集现象，叫直接库姆试验正常人O型血的Rh+的RBC+YYYY患者血清内的游离anti-Rh+Y体外加入抗人IgGYYYYYYYYYYYYYY出现凝集现象，叫间接库姆试验2.沉淀反应AgAgAgAgAbingel单向免疫扩散Ag1AbAg2Ag3Ag4双向免疫扩散免疫比浊过量AbAbAbAb毒素、组织浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原与相应抗体反应后，出现肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。沉淀反应可在液体中进行，也可在半固体琼脂凝胶中进行。鉴定多种抗原是完全相同、部分相同或完全不同用于确定抗原浓度沉淀反应—免疫电泳存在于不同区域的抗原与抗体结合，在比例适宜处形成沉淀弧。沉淀弧的数量、位置和形状与标准品相对比，可分析样品的成分及其性质。3.免疫标记技术免疫酶测定法免疫荧光技术放射免疫测定法免疫胶体金技术①免疫酶测定法夹心法ELISA间接ELISABAS—ELISA利用生物素和抗生物素蛋白为桥梁微粒捕获酶免疫分析技术将已知特异性抗体致敏的免疫微粒与生物素、亲和素、酶相结合，最后酶作用于荧光底物发光，通过检测荧光强度判断未知抗原的含量。a）b）免疫组化技术定位、定性、定量检测②免疫荧光技术③放射免疫测定用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫测定。将同位素的敏感性与抗原抗体结合的特异性结合起来，具有重复性好、准确性高等优点，广泛应用于激素、药物等微量物质的检测。常用的有131I、125I。④化学发光免疫技术将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术。最常用的发光物质是鲁米诺。灵敏度高、简便、可实现自动化分析。⑤免疫胶体金技术用胶体金颗粒标记Ab/Ag，以检测未知Ag/Ab的方法。氯金酸在还原剂作用下，可聚合成特定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液，因静电作用而呈稳定的胶体状态。该技术可应用于免疫组化(光镜下检查)和免疫层析快速诊断。⑥免疫印迹法-Westernblotting4.蛋白质芯片技术又称为蛋白质微列阵，指固定于支持介质上的大量蛋白质构成的微列阵。根据蛋白质分子间特异性结合的原理，可实现快速、准确、高通量的检测。第二节免疫细胞检测淋巴细胞及其亚群的分离免疫细胞功能测定磁珠分离法免疫吸附分离法流式细胞术肽—MHC四聚体技术T细胞功能测定B细胞功能测定细胞因子检测T细胞增殖试验迟发型超敏反应的检测抗体含量测定溶血空斑试验巨噬细胞吞噬试验细胞毒试验吞噬功能测定51Cr释放法乳酸脱氢酶释放法细胞染色法凋亡细胞检测法硝基蓝四氮唑试验生物活性检测法免疫学检测法一、免疫细胞及其亚类计数稀释血液淋巴细胞分离液(葡聚糖-泛影葡胺r=1.078)离心单个核细胞(PBMC，包括淋巴细胞、DC和NK)红细胞和粒细胞血浆外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞的分离稀释血液淋巴细胞分离液(葡聚糖-泛影葡胺r=1.078)离心单个核细胞(PBMC，包括淋巴细胞、DC和NK)红细胞和粒细胞血浆磁珠分离法免疫吸附分离法流式细胞术肽—MHC四聚体技术淋巴细胞及其亚群的分离免疫吸附分离法加入淋巴细胞悬液anti-CD4anti-CD4anti-CD4弃上清磁珠分离法流式细胞术荧光抗体标记混合细胞喷嘴单细胞悬液5000-10000个/秒细胞分选器荧光检测器抗原肽-MHC四聚体分离技术亲和素抗原肽MHCI生物素anti-CD8肽-四聚体肽特异性CD8TCD4T及B非肽特异性CD8T荧光素二、免疫细胞功能的测定T细胞功能测定B细胞功能测定细胞因子检测T细胞增殖试验迟发型超敏反应的检测抗体含量测定溶血空斑试验巨噬细胞吞噬试验细胞毒试验吞噬功能测定51Cr释放法乳酸脱氢酶释放法细胞染色法凋亡细胞检测法硝基蓝四氮唑试验生物活性检测法免疫学检测法T细胞功能测定T细胞增殖试验迟发型超敏反应的检测T细胞受到特异性抗原或有丝分裂原刺激后发生增殖，可通过以下三种方法检测：形态计数法：活化细胞体积增大、形态不规则、胞质增多、细胞核松散及出现较多核仁；3H-TdR或125I-UdR掺入法：3H-TdR能掺入到合成的DNA中，用液体闪烁仪检测样品的放射活性，特点是灵敏可靠，但须特殊仪器，易有放射性污染。MTT(四甲基偶氮唑盐)比色法：外来抗原刺激机体产生免疫应答后，再用相同的抗原作皮试，可导致迟发型超敏反应，T细胞活化并释放多种细胞因子，产生以单个核细胞浸润为主的炎症，局部发生充血渗出，24-48h发生，72h到达高峰。阳性反应表现为局部红肿和硬结，反应强烈的发生水肿甚至坏死。细胞免疫正常者出现阳性反应，细胞免疫低下者呈弱阳性或阴性反应。常用于检测某些微生物感染。B细胞功能测定抗体含量测定溶血空斑试验可通过单项琼脂扩散法、ELISA、速率比浊法等测定标本中各类Ig的含量。绵羊红细胞(SRBC)免疫动物4天后取出动物脾脏，在脾细胞悬液中含有抗SRBC的浆细胞脾细胞与SRBC在适量琼脂糖液中混匀在抗体形成细胞周围出现溶解的透明区，即溶血空斑。1个空斑区代表1个浆细胞通过记录溶血空斑的数目可知抗原特异性B细胞的数目加入新鲜补体，倒入平皿中培养细胞毒试验51Cr释放法乳酸脱氢酶释放法细胞染色法靶细胞被杀伤后，向体系中加入台盼兰，可进入膜破损的细胞内，将细胞染成蓝色。活细胞拒染而不着色。凋亡细胞检测法琼脂糖电泳法正常细胞基因组DNA凋亡细胞TUNEL法在细胞中加入末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和生物素标记的核苷酸TdT能在游离的DNA3’端缺口连接标记的核苷酸加入亲和素-酶复合物，在DNA断裂处显色流式细胞术AnnexinVPI凋亡早期凋亡晚期坏死期巨噬细胞吞噬试验吞噬功能测定硝基蓝四氮唑(NBT)试验NBT在杀菌过程中产生反应性氧中间物，其中超氧阴离子能使被吞噬进细胞内的NBT还原成不溶性蓝黑色甲臜颗粒，沉积于胞浆中。光镜下计数NBT阳性细胞可反映PMN的杀伤功能。将待测mf与鸡红细胞混合温育后，鸡红细胞被mf吞噬，根据吞噬百分率确定mf吞噬能力。吞噬百分率=吞有红细胞的mf/mf总数细胞因子检测生物活性检测法免疫学检测法夹心ELISA或ELISPOT荧光素标记抗体染胞内细胞因子，FACS分析细胞增殖或增殖抑制法，如细胞因子依赖性或抑制性细胞株细胞病变抑制法，如感干扰素抑制病毒感染性细胞损伤检测B细胞产生的抗体检测T细胞产生的CK酶联免疫斑点试验-ELISpot

对血细胞恶性变如白血病、淋巴瘤等的诊断，长期以来多应用细胞形态学检查和免疫细胞表型分析。由于这些方法在特异性和敏感性上的限制，对于丢失了细胞表面标志，或分化较好难以和正常细胞区别。也可能由于恶性细胞数量少，混在大量正常细胞中难以查出。第三节分子生物学技术在免疫学上的应用一、BCR和TCR基因重排检测

利用分子生物学，获得Ig片段的特异基因克隆及TCR各链的基因克隆，分别应用Ig基因和TCR基因重排作为B细胞和T细胞的特异标记，分别诊断B细胞来源和T细胞恶性病变引起的白血病。具体操作：从待检的细胞中分离出总DNA。非T、非B细胞的Ig和TCR基因不发生重排，称为胚基因。而T和B细胞在分化早期即有TCR和Ig基因重排，重排后的Ig和TCR片段，转移至硝酸纤维膜或尼龙膜上，然后用同位素或酶标记的Ig血病细胞进行分类鉴定。若有Ig基因重排说明恶性细胞来源于B细胞，若有TCR基因发生重排，则为T细胞来源的。如果既无Ig基因重排，又无TCR基因重排的淋巴细胞则属非T、非B细胞来源的瘤细胞。总DNA胚基因TCR和Ig基因硝酸纤维膜同位素鉴定Ig基因重排TCR基因重排无重排B细胞来源T细胞来源其他细胞来源二、限制酶切片段长度多态性