第八章分子发光分析法

第八章分子发光分析法Molecular

Luminescence

Analysis樊雪梅商洛学院化学与化学工程系18.1概述2分类：按激发的模式分类

分子发光荧光光致发光磷光

化学发光/生物发光什么叫分子发光分析法呢？——以分子发光作为检测手段的分析方法称为分子发光分析法。8.2分子荧光与磷光8.2.1基本原理1.荧光、磷光产生的机理(1)荧光、磷光的产生3

在一般温度下，大多数分子处在基态的最低振动能级。处于基态的分子吸收能量(电能、热能、化学能或光能等)后被激发为激发态。激发态是很不稳定的，它将很快地释放出能量又重新跃迁回基态。若分子返回基态时以发射电磁辐射(即光)的形式释放能量，就称为“发光”。如果物质的分子吸收了光能而被激发，跃迁回基态所发射的电磁辐射，称为荧光和磷光。4●

分子中同一轨道的两个电子自旋方向相反，即自旋配对。若分子中所有电子都是自旋配对的，该分子便处于单重态，用符号S表示。●

S为电子自旋量子数的代数和(0或1)●

电子激发态的多重度：M=2S+1●大多数有机化合物分子的基态都处于单重态。5●

基态分子（S0）吸收能量后，若电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，分子处于激发的单重态，第一、第二、…电子激发单重态用S1、S2、S3......表示。●平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低●如果电子在跃迁过程中伴随着自旋方向的变化，这时分子中便具有两个自旋不配对的电子，分子处于激发的三重态，用符号T表示。第一、第二、…电子激发三重态T1

、T2…传递途径辐射跃迁荧光磷光内转化外转移系间窜越振动弛豫无辐射跃迁

处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式回到基态。振动弛豫：同一电子能级内由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。内转化：同多重态电子能级中,等能级间的能级交换。外转移：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁。系间窜越：不同多重态，有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。●非辐射能量传递过程●辐射能量传递过程

荧光：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态(S1→S0)。

发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长。λ发射>λ吸收磷光：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态(T1→S0)；电子由S0进入T1的可能过程：

S0→激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→T1

S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间窜越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫荧光与磷光的区别：(1)荧光是由激发单重态最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的；而磷光是由激发三重态的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。(2)荧光时间短，磷光时间长。(2)荧光、磷光的寿命和量子产率a.

荧光、磷光的寿命分子在激发态的平均时间。对于处于S1(T1)电子态的荧光体来说，其平均寿命()

可表示为：kF(P)--荧光（磷光）发射过程中的速率常数。ki--各种分子内非辐射衰变过程的速率常数总和。b.

荧光、磷光的量子产率kF、kp主要取决与荧光物质的分子结构；

ki主要取决与化学环境，同时也与荧光物质的分子

结构有关。st系间窜跃效率。大多数荧光物质的量子产率在0.1~1之间。例如：0.05mol/L的硫酸喹啉，F

=

0.55；荧光素F

=

12.荧光、磷光与分子结构的关系(1)分子产生荧光必须具备的条件a:具有合适的结构；b:具有一定的荧光量子产率。

荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射。(2)荧光与有机化合物的结构a.跃迁的类型π*

→π

π*→n

对于有机荧光物质:

n→π*

εmax＜100平均寿命10-5~10-7sπ→π*

εmax≥104平均寿命10-7~10-9skS→T小π*→π

是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。苯萘蒽

λexmax(nm)205286365390580λemmax

(nm)278321400480640F0.110.290.460.600.52共轭效应使荧光增强的原因：主要是由于增大荧光物质的摩尔吸光系数，有利于产生更多的激发态分子，从而有利于荧光的发生。产生荧光的有机物质，都含有共轭双键，共轭体系越大，离域大π键的电子越易激发，荧光与磷光越易产生。b.

共轭效应c.刚性平面结构芴

F=1联苯

F=0.2

荧光物质的刚性和平面性增加，有利于荧光发射。原因：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，也就减少了碰撞去活的可能性。—HN2，—NHR，—NR2，—OH，—OR，—CN产生p→π共轭化合物苯苯酚苯胺苯基氰苯甲醚λemmax(nm)278~310285~365310~405280~390285~345荧光强度1018202020d.取代基效应●

给电子取代剂加强荧光●

得电子取代基减弱荧光、加强磷光—C=0，—COOH，—NO2不产生

p→π共轭硝基苯：不产生荧光、弱磷光二苯甲酮：弱荧光、强磷光空间位阻对荧光发射的影响●

取代基的位置反式二苯乙烯强荧光物质F=0.75F=0.03异构体对荧光发射的影响顺式二苯乙烯非荧光物质●

重原子取代基效应（-Cl，-Br，

-I）

S1→T1的系间窜跃由于重原子的存在而增强。含有重原子的溶剂，重原子效应使得荧光强度减弱、磷光强度增强。3.影响分子发光的环境因素(1)溶剂的影响溶剂的极性、氢键、配位键的形成都会影响荧光强度。(2)温度的影响温度增加，外转换去活的几率增加，荧光强度减弱。(3)溶液pH的影响

对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制。OH-H+OH-H+pH=1,有荧光pH=13,无荧光无荧光有荧光4.金属螯合物的荧光除过渡元素的顺磁性原子会发生线状荧光光谱外，大多数无机盐类金属离子，在溶液中只能发生无辐射跃迁，因而不产生荧光。但是，在某些情况下，金属螯合物却能产生很强的荧光，并可用于痕量金属元素分析。

不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构，分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构的增大，常会发生荧光。8-羟基喹啉弱荧光8-羟基喹啉-Zn螯合，黄绿色，强荧光(1)螯合物中配位体的发光(2)螯合物中金属离子的特征荧光

这类发光过程通常是螯合物首先通过配位体的跃迁激发，接着配位体把能量转给金属离子，导致dd跃迁和ff跃迁，最终发射的是dd跃迁和ff跃迁光谱。S0S1d*、f*系间窜跃分子内能量转移

d*→df*→f荧光T15.荧光、磷光的猝灭荧光猝灭：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或消失的现象。荧光猝灭剂：这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧光

猝灭剂。(1)

碰撞猝灭

指处于激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子相碰撞，使激发单重态的荧光分子以无辐射跃迁的方式回到基态，产生猝灭作用。(3)生成化合物的猝灭(静态猝灭)(2)

能量转移猝灭指基态的荧光物质与猝灭剂反应生成非荧光的化合物，导致荧光的猝灭。

氧分子是荧光、磷光的猝灭剂。有人认为是由于三重态的氧分子和激发单重态的荧光分子相互作用形成激发单重态的氧分子和激发三重态的荧光分子所引起的。(4)氧的猝灭作用

也有人认为氧和其它顺磁性的物质一样，它们之所以会使荧光猝灭，是由于它们能够促进激发单重态的荧光分子的系间跨跃；还有的认为荧光猝灭是由于荧光物质受到氧化的缘故。(5)自猝灭与自吸收当荧光物质的浓度大于1g/L时，常发生荧光的自猝灭。自吸收：形成二聚体：有的二聚体使荧光强度降低甚至不发荧光。6.激发光谱与发射光谱荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？(1)荧光(磷光)的激发光谱曲线

固定发射波长(选最大发射波长),做荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线图。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。

激发光谱与紫外-可见吸收光谱类似。(2)荧光光谱(或磷光光谱)固定em=

620nm(MAX)ex=290nm(MAX)固定最大激发波长,做荧光(或磷光)强度与发射光波长关系曲线。(3)

激发光谱与发射光谱的关系a.

Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光。c.

镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱(与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。ex=290nm(MAX)固定em=620nm(MAX)固定ex=290nm(MAX)em=620nm(MAX)S04321S143211→

41→

31→

21→11

→41

→

31

→21

→17.荧光（或磷光）强度与溶液浓度的关系

荧光强度If正比于吸收的光量Ia与荧光量子产率。

If

=

Ia又根据Beer定律：Ia=I0-It=I0(1-e-

b

c)I0和It分别是入射光强度和透射光强度。代入上式得：

If=I0(1-e-

bc)=

I0(1-e-2.3

bc)整理得：If

=2.3I0bc当入射光强度I0和b一定时，上式为:

If=Kc

这种线性关系只有在极稀的溶液中，当bc<0.05时才成立。对于较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光强度和浓度不呈线性关系。同理：

IP=Kc

主要组成部件光源氙灯激发单色器样品池光电倍增管数据处理仪器控制光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器发射单色器8.2.2荧光、磷光分析仪器

由光源发射的光经第一单色器得到所需的激发光波长，通过样品池后，一部分光能被荧光物质所吸收，荧光物质被激发后，发射荧光。为了消除入射光和散射光的影响,荧光的测量通常在与激发光成直角的方向上进行。为消除可能共存的其它光线的干扰，如由激发所产生的反射光、Raman光以及为将溶液中杂质滤去，以获得所需的荧光，在样品池和检测器之间设置了第二单色器。荧光作用于检测器上，得到响应的电信号。1.激发光源

在紫外-可见区范围，通常的光源是氙灯和高压汞灯。2.样品池

通常用石英，形状以方形和长方形为宜。3.单色器光栅4.检测器由光电管和光电倍增管作检测器，并与激发光成直角。问题：紫外-可见分光光度计与荧光分光光度计有什么区别？光源样品池单色器检测器数据处理仪器控制光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器I0ItI0ItIF,p紫外-可见分光光度计：两面透光荧光分光光度计：四面透光8.2.3荧光分析法的应用1.无机化合物

在紫外光照射下会发生荧光的无机化合物很少，主要依赖于有机试剂形成的螯合物。(1)直接荧光测定法自从1867年Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定以来，采用有机试剂可以测定70多种元素。其中，较常测定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd与某些稀土元素。某些元素虽然不与有机试剂形成发荧光的配合物，但是它会与发荧光的配合物争夺配位体，组成不发荧光的配合，使其产生荧光熄灭，由荧光熄灭的强度可测定该元素的含量。(2)荧光熄灭测定法较常测定的元素有：F、S、Fe、Ag、Co、Ni、Cu、

Mo、W等。(3)催化荧光测定法某些元素虽然与有机试剂形成发荧光的配合物，但是反应速度慢，在某些微量元素的催化下，反应速度会加快，在特定的时间内可用来测定微量元素。某些微量元素存在，会催化发荧光的配合物产生荧光熄灭，在特定的时间内可用来测定微量元素。常测定的元素有：Cu、Be、Fe、Co、Os、Ag、Au、

Zn、Al、Ti、V、Mn、Er、H2O2、CN2.有机化合物芳香族化合物存在共轭的不饱和体系，是有机化合物荧光测定的主要类型。待测物试剂λexmaxλemmax测定范围ppm丙三醇苯胺紫外蓝色0.1~2糠醛蒽酮4655051.5~15氨基酸氧化酶3154250.01~50维生素A无水乙醇3454900~20蛋白质曙红丫紫外5400.06~6肾上腺素乙二胺4205250.001~0.02青霉素α-甲氧基-６-氯-９-(β-氨乙基)-氨基氮杂蒽4205000.0625~0.625玻璃酸梅3-乙酰氧基吲哚3954700.001~0.033胍基丁胺邻苯二醛3654700.05~5四氧嘧啶苯二胺36548510-48.3化学发光分析法8.3.1

概述

某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出一定波长的光。这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光。利用化学发光反应而建立起来的分析方法称为化学发光分析法。化学发光也发生于生命体系，这种发光称为生物发光。在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。

A+B=C+D*D*→D+h化学反应必须满足如下条件：(1)化学反应必须提供足够的激发能，激发能主要来源于

反应焓。(2)要有有利的化学反应历程，使化学反应的能量至少能

被一种物质所接受并生成激发态。(3)激发态能释放光子或能够转移它的能量给另一个分，

而使该分子激发，然后以辐射光子的形式回到基态。8.3.2

基本原理1.化学发光反应化学效率：发光效率：时刻t的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：dc/dt分析物参加反应的速率。2.化学发光效率8.3.3化学发光的类型1.

直接化学发光和间接化学发光(1)直接化学发光指被测物作为反应物直接参加化学发光反应，生成电子激发态产物分子，此初始激发态能辐射光子。A+BC*+DC*C+h式中A或B是被测物，通过反应生成电子激发态产物C*，当C*跃迁回基态时，辐射光子。(2)间接发光是被测物A或B，通过化学反应生成初始激发态产物C*，C*不直接发光，而是将其能量转移给F