THSPP 0005-2022 茄科植物携带柑橘裂皮类病毒检测技术规程

ICS65.020.20CCSB16团 体 标 准T/HSPP0005—2022茄科植物携带柑橘裂皮类病毒检测技术规程CodeofPracticeforDetectionofCitrusexocortisviroidcarriedbySolanaceaeplants(发布稿)2022-10-10发布 2022-11-10实施湖北省植物保护学会 发布T/HSPP0005—2022T/HSPP0005—2022II目 次前 言 II1范围1-21-31-4-1-51-仪器设备1-主要试剂1-61-7检测方法1-样品制备2-7.1.1种子类2-7.1.2种苗类2-RNA2-2-分子杂交2-结果判定3-8-3-留样保存3-结果记录3-建档3-附 录 A（参性）柑裂类毒本息-4-附 录 B（参性录核酸取法-5-附 录 C（参性录分子交法-6-附 录 D（规性录）橘皮病检流程图-8-T/HSPP0005—2022T/HSPP0005—2022IIII前 言GB/T《标准化工作导则第本文件主要起草人：王琴、张建坤、许剑涛、孙俊、徐文兴、李倩、李乔、徐雪、华益、赵梅荣、刘振、郑鑫浩、孙民琴、李彬、吴翠萍、王振华。T/HSPP0005—2022T/HSPP0005—2022-PAGE3-茄科植物携带柑橘裂皮类病毒检测技术规程范围本文件规定了柑橘裂皮类病毒的检测技术规程。本文件适用于番茄、辣椒、马铃薯等茄科植物种子及种苗中柑橘裂皮类病毒的检测和鉴定。（GB/T66822964本文件没有需要界定的术语和定义。exocortisviroid类病毒名及缩写：citrusexocortisviroid，CEVdPospvodaPospvroA。感量0.001PHPCR（2.5μL20μL，1000μL）除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。商品化Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇、反转录酶、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸、PCR缓冲液、引物和探针、Tris-乙酸电泳缓冲液，硝酸银溶液等。核酸提取相关试剂符合附录B的要求；分子杂交试剂应符合附录C的要求。DSN/T2964样品制备每份送检样本中选取100~200粒种子，表面消毒后，置于铺有吸水纸的白瓷盘或培养皿中，20℃~25℃、12h/12h光暗交替条件下保湿培养直至萌发。随机抽取叶片1g~5g，置于去RNA酶的研钵中，加入液氮后迅速研磨成细粉状，制成检测样品。g~200RNARNA提取100TrizolRNACEVdCEVdB。核酸提取也可选择相应商业化试剂盒。RT-PCR检测cDNA0.2mLPCR管中加入DEPC处理去离子水10μL、模板RNA3μL（50ng~200ng），随机引物1μL，95℃（或沸水）水浴7min，迅速置冰上冷却3min；然后加5×反转录缓冲液4μL、10mmol/LdNTPs、40U/μLRNAase抑制剂（Rnasin）0.5μL、200U/μL反转录酶（M-MLV）0.5μL，混匀后37℃水浴1h；反转录结束后瞬时离心，95℃（或沸水）水浴5min，冰浴3min，直接进行PCR扩增。cDNA合成也可采用相应商业化试剂盒。PCR反应体系：0.2mLPCR管中加入10×PCRbuffer（含Mg2+）2.5µL，dNTPs（10mmol/L）2µL，引物（均为10μmol/L）各1.0μL（见表1），5U/µLTaq酶0.5µL，模板cDNA3μL，加DEPC处理水至总体积25µL。每个样品设置两个平行反应，以双蒸水代替模板作为空白对照。表1PCR反应特异性引物及序列引物名称引物序列（5'-3'）产物大小（bp）CEVd371FCCGGGGATCCCTGAAGGA371CEVd371RGGAAACCTGGAGGAAGTCG反应程序：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。也可采用一步法RT-PCR商业化试剂盒，反应体系和反应条件可根据说明书进行适当调整。制备1.5%15PCR110Vmin）对RT-PCR扩增产物进行测序，将测得序列与GenBank数据库中已知的CEVd序列进行相似性比对分析，验证样品检测结果。分子杂交RocheCEVdRNA-20℃33min68℃12μLRNA10h具体操作步骤参见附录C。结果判定对照成立的前提下，检测结果按照以下原则进行判定：——样品RT-PCR和分子杂交两种检测方法均为阳性，可判定样品中携带有柑橘裂皮类病毒；——样品RT-PCR检测或分子杂交检测结果为阳性，经测序分析验证与已知的CEVd序列相似性达90%以上，可判断样品携带柑橘裂皮类病毒；——样品RT-PCR和分子杂交两种检测方法均为阴性，可判定样品未携带柑橘裂皮类病毒。留样保存检出柑橘裂皮类病毒的种子、生长苗木样品以及7.1剩余制样于-80℃冰箱内保存。样品应保存至少6个月。保存期满后，应经高压灭菌后方可处理。结果记录RT-PCR检测结果电泳照片、分子杂交检测结果照片、测序报告和序列分析结果图应一并保存。建档--PAGE8-附 录 A（资料性附录）柑橘裂皮类病毒基本信息芸香科（Rutaceae）、马铃薯（Solanumtuberosum）、番茄（Solanumlycopersicum）、（Solanum（Petunia（Daucus（Petunia（Gynura）、柑橘属（Citrus）、香橼（Citrusmedica）等。CEVd通过嫁接、花粉、种子和刀具机械传播。远距离通过种苗调运传播。/接穗的柑橘上的症CEVdCEVd基因组为单链环状RNA分子，基因组大小约371nt，GC含量高，分子内部碱基配对形成稳定的杆状或拟杆状二级结构，在一定条件下可形成发夹状变形结构。CEVd基因组包含5个功能区：左末端区(TL)、致病区(P)、中央保守区(C)、可变区(V)和右末端区(TR)。附 录 B（资料性附录）核酸提取方法DEPC处理超纯水：取制备好的去离子水500mL，加入500μLDEPC摇床震荡过夜，高温高压灭菌后室温保存；1mol/LTris-HCl（pH8.0）：称取12.11gTris·base，加50mLDEPC处理超纯水溶解，用浓HCl调pH值至8.0，定容至100mL，高温高压灭菌后室温保存；0.5mol/LEDTA（pH8.0）：称取18.61gNa2EDTA·2H2O，加80mL处理超纯水溶解，用约2gNaOH调pH值至8.0，加DEPC100μL，定容至100mL，摇床震荡过夜，高温高压灭菌后室温保存；10×TE（pH8.0）：取1mol/LTris-HCl（pH8.0）10mL和0.5mol/L（pH8.0）2mL，加50mLDEPC处理超纯水溶解，定容至100mL，高温高压灭菌后室温保存。称取7.1制备的检测样品100mg，转入已灭菌的去RNA酶离心管；立即加入1mLTrizol，涡旋振荡15s，室温静置15min；加400μL氯仿，上下颠倒混匀，室温静置2min，4℃12000r/m离心15min；取上清于新的离心管中，加无加入等体积的异丙醇沉淀，轻微颠倒，-20℃沉降1h；12000r/m离心15min；弃上清，沉淀中加1mL预冷的75%酒精，上下颠倒10次，12000r/m离心5min，弃上清；瞬间离心20s，吸去多余液体，室温干燥5-10min，加30μLDEPC处理的去离子水溶解，-80℃冰箱保存备用。也可选择市售商品化提取试剂盒进行核酸提取。附 录 C（参考性附录）分子杂交方法C.1试剂与材料C.1.1核酸杂交相关试剂175.3gg800mLHCl调pH值至7.0，最后用定容至1L，高温高压灭菌后室温保存；50×Denhardt’s1gFicoll400，1gPVP-40，1gBSA80mL100-206×SSC5×Denhardt50%(w/v)Formamide0.5%(w/v)SDS100μg/mL鲑鱼精DNA（用前加热变性后加入）；杂交液：预杂交液中加入DIG-RNA探针，稀释成适当浓度；0.73gNaCl，0.24gNa2HPO4，0.1gNaH2PO4，5gSDS80mL水中，100洗涤液I：为1/10稀释的封闭液；洗涤液II：将0.24gTris·base，1.16gNaCl，0.4gMgCl2溶于160mL水中，用HCl调pH至9.5，定容至200mL，过滤除菌后室温保存；MOPS200mmol/LMOPSpH7.050mmol/LNaAc10mmol/LMaleicacid100mmolMaleicacid、150mmolNaCl，pH7.5；洗膜缓冲液：100mmolMaleicacid、150mmolNaCl、0.3%(v/v)Tween20，pH7.5；检测缓冲液：100mmolTris-HCl(pH9.5)、100mmolNaCl；抗地高辛的酶标抗体：Anti-DIG-AP；CSPD：25mmolCSPD（用前稀释）；带正电的尼龙膜为AmershamPharmaciaBiotech公司的产品。挑取CEVd全长cDNANdeT7RNARNA探1μg4μL5×2μL标记dNTPs和2μLT7RNA0.5μLRNA37℃2hRNA方法同B.2。RNA1）取3μLRNA加7μL变性缓冲液(33%甲醛、50%去离子甲酰胺和1×MOPS)，65℃水浴15min，冰浴5min，促使核酸变性；2)然后取变性核酸点于带正电荷的尼龙膜上，每次3μL，点好后将膜晾干；（Hoefer-Uvc500，AmershamBiosciencesCorp.）1200×100J/cm23min；6×SSC（FisherScientificInternationalInc.）68℃1h；5510h；20mL~40mL2×SSC0.1%SDS5min20mL~40mL0.1×SSC0.1%SDS6815min采用Rochecm2100mL30min；1：1