中医药研究常用分子生物学技术课件

中医药研究常用分子生物学技术

教学参考资料唐炳华、王继峰:医学分子生物学(第一版）,中国中医药出版社,2006年胡维新:医学分子生物学（第一版）,科学出版社,2007年T.A.Brown著，魏群等译：基因克隆和DNA分析（第五版），高等教育出版社，2003年王艳明、周坤福、徐力：分子生物学与中医药研究，上海中医药大学出版社，2000年RobertF.Weaver：MolecularBiology（3rded），

McGraw-HillPress.2005[美]J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著，黄培堂等译：分子克隆实验指南（第三版），科学出版社，2002年朱玉贤、李毅、郑晓峰：现代分子生物学（第三版），高等教育出版社，2007年

教学参考资料卢圣栋：现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993年J.D.WatsonetalMolecularBiologyoftheGene

5thTheBenjamin/CummingsPublishingCompany,Inc.2003Lewin,B.,GENES

Ⅷ.UniversityPress,Oxford.2004孙乃恩孙东旭朱德煦：分子遗传学（第二版），南京大学出版社，1997年网址：（参见教材P274表7-3）第一章绪论一、什么是分子生物学分子生物学已广泛渗透到医学科学的各个领域，成为现代医学的理论基础。微生物学临床各学科细胞学免疫学病理学药理学生理学分子生物学二、分子生物学的主要研究内容

（一）分子生物学理论1、核酸的分子生物学：研究核酸的结构及其功能。分子遗传学（moleculargenetics）是其主要研究内容包括①核酸/基因组的结构，②遗传信息的复制，③转录与翻译，④核酸存储的信息突变与修复，⑤基因表达调控和基因工程技术的发展和应用等。遗传信息传递的中心法则（centraldogma）是其理论体系的核心。二、分子生物学的主要研究内容

（一）分子生物学理论：1、核酸的分子生物学：研究核酸的结构及其功能。（二）

分子生物学技术1、基本技术分光光度技术；电泳技术（琼脂糖凝胶电泳，醋酸纤维素薄膜电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳，等电聚焦，λ噬菌体的限制性内切酶酶切片段）；放射性同位素技术；色谱技术（层析法，吸附色谱法，分配色谱法，离子交换色谱法，凝胶色谱法，亲和色谱法，高效液相色谱法）；细胞培养等二、分子生物学的主要研究内容（二）

分子生物学技术2、核酸操作技术核酸的提取和纯化；DNA、RNA合成技术；DNA重组技术；核酸杂交技术；DNA序列测定技术等。3、实用蛋白技术蛋白质的提取和纯化；蛋白质测定；蛋白质印迹技术；蛋白质质谱分析技术等。二、分子生物学的主要研究内容分子生物学中的两项最重要的实验技术

分子生物学的诞生和发展中的瓶颈基因克隆（DNA重组，基因工程）

(Geneclone,DNArecombination,geneengineering)

基因转移载体的发现vectorDNA操作工具酶的发现DNAmanipulation

基因合成和基因测序sequencePCR技术(polymerasechainreaction)三、分子生物学的发展简史

（一）准备和酝酿阶段

19世纪后期到20世纪50年代初，是现代分子生物学诞生的准备和酝酿阶段。在这一阶段产生了两点对生命本质的认识上的重大突破：

1、确定了蛋白质是生命的主要基础物质2、确定了生物遗传的物质基础是DNA1944年O.T.Avery等证明了肺炎球菌转化因子是DNA1952年A.D.Hershey和M.Cha-se用DNA35S和32P分别标记T2噬菌体的蛋白质和核酸

,证明遗传物质是DNA。（二）现代分子生物学的建立和发展阶段

这一阶段是从50年代初到70年代初，以1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑，开创了分子遗传学基本理论建立和发展的黄金时代。

1、中心法则的建立Watson和Crick就提出DNA复制的可能模型。1956年A.Kornbery首先发现DNA聚合酶。1958年Meselson及Stahl用同位素标记和超速离心分离实验为DNA半保留模型提出了证明。1968年Okazaki（冈畸）提出DNA不连续复制模型。（二）现代分子生物学的建立和发展阶段1972年证实了DNA复制开始需要RNA作为引物

1958年Weiss及Hurwitz等发现依赖于DNA的RNA聚合酶

1961年Hall和Spiege-lman用RNA-DNA杂交证明mRNA与DNA序列互补

60年代Nirenberg、Ochoa以及Khorana等几组科学家的共同努力破译了RNA上编码合成蛋白质的遗传密码

1970年Temin和Baltimore又同时从鸡肉瘤病毒颗粒中发现以RNA为模板合成DNA的反转录酶

（三）初步认识生命本质并开始改造生命的深入发展阶段

70年代后，以基因工程技术的出现作为新的里程碑，标志着人类深入认识生命本质并能动改造生命的新时期开始。其间的重大成就包括：

1、重组DNA技术的建立和发展1967-1970年R.Yuan和H.O.Smith等发现的限制性核酸内切酶为基因工程提供了有力的工具；1972年Berg等将SV-40病毒DNA与噬菌体P22DNA在体外重组成功，转化大肠杆菌，使本来在真核细胞中合成的蛋白质能在细菌中合成,打破了种属界限；1、重组DNA技术的建立和发展1977年Boyer等首先将人工合成的生长激素释放抑制因子14肽的基因重组入质粒，成功地在大肠杆菌中合成得到这14肽

1979年美国基因技术公司用人工合成的人胰岛素基因重组转入大肠杆菌中合成人胰岛素。

1、重组DNA技术的建立和发展我国已有人干扰素、人白介素2、人集落刺激因子、重组人乙型肝炎疫苗、基因工程幼畜腹泻疫苗等多种基因工程药物和疫苗进入生产或临床试用。1982年Palmiter等将克隆的生长激素基因导入小鼠受精卵细胞核内，培育得到比原小鼠个体大几倍的“巨鼠”。1991年美国向一患先天性免疫缺陷病（遗传性腺苷脱氨酶ADA基因缺陷）的女孩体内导入重组的ADA基因，获得成功。

1994年我国用导入人凝血因子Ⅸ基因的方法成功治疗了乙型血友病的患者。

2、分子生物学技术的应用和发展

⑴癌基因的发现⑵基因诊断⑶基因组文库的建立⑷基因工程生产人胰岛素⑸转基因动物⑹人类基因治疗⑺基因工程抗体技术的建立和发展⑻DNA芯片技术（基因芯片、生物芯片）3、基因组研究的发展

1977年Sanger测定了ΦX174-DNA全部5375个核苷酸的序列；

1978年Fiers等测出SV-40DNA全部5224对碱基序列；

20世纪80年代λ噬菌体DNA全部48,502碱基对的序列全部测出；

1996年底许多科学家共同努力测出了大肠杆菌基因组DNA的全序列长4x106碱基对。

1990~2003年人类基因组计划（HumanGenomeProject）实施并基本完成。4、基因表达调控机理

1961年，Jacob，F.和Monod，J.提出了操纵子模型，打开了人类认识基因表达调控的窗口。20世纪70年代以后才逐渐认识了真核基因组结构和调控的复杂性。

1977年最先发现猴SV40病毒和腺病毒中编码蛋白质的基因序列是不连续的，揭开了认识真核基因组结构和调控的序幕。

1981年Cech等发现四膜虫rRNA的自我剪接，从而发现核酶（ribozyme）。

20世纪80-90年代，使人们逐步认识到真核基因的顺式调控元件与反式转录因子、核酸与蛋白质间的分子识别与相互作用是基因表达调控根本所在。

6、小分子RNA研究进展1993年，LeeRC等发现线虫（C.elegans）lin-4基因编码的长度为22~61b的小分子RNA关闭线虫不同发育阶段mRNA转录的作用，这是继核酶以后，内源性RNA参与基因调节的又一证据。小分子RNA(miRNA或siRNA）具有调控基因表达的功能。miRNA可以通过部分互补结合到目的mRNA的3′非翻译区，抑制蛋白质合成。这种结合并不诱导目的mRNA的降解。siRNA能诱导细胞内基因沉默，与长双链RNA有同源序列的mRNA被降解，从而抑制基因的表达。二十一世纪生物学的新热点及领域

结构生物学（StructuralBiology）

生物大分子的高级三维结构与功能的统一生物大分子之间的互作→基因的社会学分子发育生物学（MolecularDevelopingBiology）基因表达，基因互作

器官发生胚胎形成个体发育五、分子生物学技术在中医药研究中的应用

（一）在中医基础理论研究中的应用1、证本质的研究近年来运用分子生物学技术对肾的实质、活血化瘀理论及中药抗衰老机理进行研究例①沈自尹等采用RT-PCR法进行了“补肾健脾活血三类复方对下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺轴及促肾上腺激素释放因子（CRF）基因表达的影响”的研究，其目的是从分子水平来阐述药物对肾阳虚证的主要调节点。例②陈可冀等应用斑点印迹杂交、原位杂交、和3H-TdR掺入细胞DNA等技术，证明活血化瘀类中药都可抑制血管壁血小板衍化生长因子（PDGF）基因及血管壁原癌基因c-mycmRNA的表达水平，从而抑制动脉平滑肌细胞增生，阻止动脉粥样硬化。研究表明，活血化瘀类中药干预基因调控、抑制原癌基因表达。例③沈小珩采用分子生物学技术对二仙汤及其拆方影响老年大鼠肝组织超氧化物岐化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性及其基因表达水平的观察发现，老年大鼠氧化脂质（LPO）含量明显提高，超氧化物岐化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性降低，而且与这类编码这类酶的基因表达水平密切相关，用二仙汤及其拆方治疗后，大鼠氧化脂质（LPO）含量明显降低，提高了超氧化物岐化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性。五、分子生物学技术在中医药研究中的应用

（一）在中医基础理论研究中的应用2、治则治法的研究科研人员用抑癌扶正行气活血法治疗经二乙基亚硝胺诱导的肝癌大鼠，采用DD-PCR（差异显示技术）和Northernbolt对治疗后大鼠肝组织进行检测，发现肝癌组织若干癌基因转录水平降低。（见P8）五、分子生物学技术在中医药研究中的应用

（二）在中医临床上的应用吴志奎等进行了“补肾生血方对β-地中海贫血基因水平的影响”的研究，结果发现，补肾生血药能明显提高β-地中海贫血患者血红蛋白（Hb）和抗碱血红蛋白（HbF），提高血红蛋白的珠蛋白链比。起作用机制可能是补肾生血药能提高珠蛋白链γ/β+γ比值，促进γ-珠蛋白基因的表达，诱导HbF合成，从而代偿了β-珠蛋白基因功能缺陷。五、分子生物学技术在中医药研究中的应用

（三）在针灸研究中的应用1、针刺镇痛与C-fos、C-jun、CC-k基因的研究2、耳针与表皮生长因子RACTH的研究3、电针抗痫与CCK基因表达的研究4、电针与抗脑缺血与C-fos原癌基因表达的研究5、针刺抑制老年大鼠与垂体细胞因子基因表达6、电针对细胞凋亡的影响7、针刺对脊髓背角内生长期相关蛋白GAP43表达的影响8、针刺对雌性大鼠垂体雌激素受体mRNA表达和血雌二醇（E2）水平影响的研究9、“醒脑开窍”针法对实验性脑梗死大鼠脑细胞核糖核酸的影响（四）在中药研究中的应用1、鉴定中药材及药用植物资源保护常用DNA分子标记法，其是指以DNA多态性为基础的遗传标记。

DNA分子遗传标记常用的方法是RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA——随机引物扩增多态DNA)是1990年由Williams等发展起来的。分子标记主要应用：

遗传育种

生药鉴定和药材道地性

五、分子生物学技术在中医药研究中的应用

2、获取有效成分一是