生化实验(七)-综合性实验之三-血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 2013

综合性实验三

血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳1.掌握醋酸纤维膜电泳的基本原理及其临床意义;2.掌握醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质的操作技术;3.熟悉电泳仪器的使用和操作。一、实验目的：二、实验原理：（一）电泳(electrophoresis)：带电粒子在电场中向与其电性相反的电极方向泳动的现象。正极负极带负电粒子带正电粒子电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。1.球形带电颗粒在电场作用下所受的力电场力F=XQ

(X－电场强度，Q－粒子所带电荷)阻力F'=6πrηv

(r－粒半径，η－介质粘度，v－粒运动速度)当F=F'，(电泳达平衡)，XQ=6πrηv移项得v/X=Q/6πrη迁移率

(mobility):U=v/X=Q/6πηrv/X,

单位电场强度时粒子运动的速度带电粒子的迁移率在一定条件下取决于粒子本身的性质：即与其所带电量成正比；与其半径及介质粘度成反比。移动速度:v=d/t(cm/秒)电场强度:X=E/l(伏特/cm)(单位距离内电势差)d/tE/ldlEt2.两种不同物质的电泳分离迁移率U=v/X=——=——

(单位:cm2·伏特-1·秒-1)物质(A)在电场中移动的距离为dA=UA

·

Et/l物质(B)在电场中移动的距离为dB=UB

·

Et/l两物质移动距离的差为Δd=dA-dB=(UA

–

UB)·

Et/l物质A和B能否分离取决于两者迁移率。如两者的U相同，则不能分离；如有差别则能分离。两物质的分离距离：与电压和电泳时间成正比，与电场的距离成反比。小结：带电粒子的迁移率在一定条件下取决于粒子本身的性质：即与其所带电量成正比；与其半径及介质粘度成反比。两物质的分离距离：与电压和电泳时间成正比，与电场的距离成反比。电泳法：利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的方法和技术。（二）影响电泳速度的因素⒈样品本身带电量：Q

越多，v越大。分子大小：r越小，v越大。形状：球形分子>纤维状分子。⒉电场强度：X

越大，v越大。d=U·Et/l

U=v/X=Q/6πηrV=d/t=U·E/l

=U·X

=Q·E/(6πηr·l)⒊缓冲液成分：性质稳定，不易电解。pH：pH-pI越大，Q越多，v越大。离子强度：0.02～0.2M。I越大，样品电流减小，v变小；I越小，样品电流越大，v越大，但样品易扩散。⒋支持介质：惰性材料，有一定坚韧度，易保存；吸附力要小；无电渗作用。电渗：液体对固体的相对移动，由缓冲液的水分子和支持介质的表面之间所产生的一种相关电荷所引起。电渗与电泳方向相同，v

变大；反之变小。简言之，在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗（electro-osmosis）。原因：固体支持物多孔，带可解离化学基团，常吸附溶液中正离子或负离子，使溶液相对带负电或正电。如以滤纸作支持物时，纸上纤维素吸附OH-带负电荷；而与纸接触的水溶液因产生H3O+带正电荷。因此，若样品质点在电场中移向负极，结果质点的表现速度比其固有速度要快，若质点是移向正极，则表现速度比其固有速度要慢，可见应尽可能选择低电渗作用的支持物以减少电渗的影响。甚至，当电渗作用大于电泳时，样品质点可“不进反退”，向电泳相反方向移动。附：电渗⒌温度：过高，产热增加、水分蒸发，对电泳不利。产生热量(Q=I2Rt)对电泳技术不利，因产热可促使支持介质上溶剂蒸发，而影响缓冲溶液离子强度。温度升高，介质粘度下降，分子运动加剧，自由扩散变快，迁移增加。为降低热效应对电泳影响，可控制电压或电流，也可安装冷却散热装置。对高压电泳增设冷却系统，防样品变性。■影响电泳迁移率的因素：FrictionCharge外加电流、电压分子量分子形状分子的等电点VoltageCATHODEANODE+--+FrictionCharge在确定的条件下，某物质的迁移率为常数，是该物质的化学特征常数醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法。血清中各种蛋白质的等电点在pH4.0～7.3之间，在pH8.6的缓冲溶液中均带负电荷，在电场中向正极泳动。血清中各种蛋白质的等电点不同，所以带电荷量也不同。此外各种蛋白质的分子大小各有差异，因此在同一电场中泳动的速度不同。分子小而带电荷多者，泳动较快；反之，则较慢。（三）血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳原理+白蛋白(A)α1α2

βγ定量----将染色后的区带分别剪开，将其溶与碱液，进行比色测定，计算各区带的百分数。醋酸纤维素薄膜具有均一的泡沫状结构（厚约120m），渗透性强，对分子移动的阻力很弱。用其作支持物进行电泳，具有微量、快速、简便、分离清晰、对样品无吸附现象等优点。现已广泛用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、血红蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。三、实验器材1.电泳仪：为电泳提供直流电源。2.电泳槽：为电泳提供场所。多用有机玻璃制成，电极用铂丝。3.血清加样器：可用盖玻片或X胶片或微量加样器。4.醋酸纤维素薄膜：2cm×8cm5.其它：培养皿（直径9-10cm）、滤纸、玻璃板、镊子等。DYY-5型稳压稳流电泳仪DYY-Ⅲ型电泳槽

四、实验试剂和材料1、巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH=8.6，离子强度0.075)：称取1.66g巴比妥和12.76g巴比妥钠,置于大烧杯中，加蒸馏水约600ml，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定溶至1000ml。置4℃保存，备用。2、染色液：称取0.5g氨基黑，甲醇50ml，冰醋酸10ml，蒸馏水加至100ml。3、漂洗液：取无水乙醇45ml，冰乙酸5ml和蒸馏水50ml，混匀置塞试剂瓶内贮存。3、0.4N氢氧化钠：称取氢氧化钠16.0g，蒸馏水加至1000ml1.醋酸纤维素薄膜的润湿与选择

将醋酸纤维素薄膜完全浸泡于缓冲液中5-10分钟后。

每组取醋酸纤维素薄膜1张，取时用镊子夹住薄膜一端，风干或置于试管上，晾干，注意区分薄膜的“光面”和“毛面”。

五、实验操作步骤（一）仪器与薄膜的准备

2.电泳槽的准备

点样时，先在醋酸纤维薄膜的无光泽面距一端1.5cm处，预先用铅笔划一条线作为点样线，在缓冲液中浸泡10分钟后，晾干，去除多余的缓冲液(防止样品扩散稀释)，用点样器的边缘沾上血清后，在点样线上迅速地压一下，使血清通过点样器印吸在薄膜上，点样力求均匀。（见图）。此步是实验的关键。醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图（虚线处为点样位置）（二）点样

(先划线，再浸泡)

将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上(见下图)。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。

连接好电泳仪。在室温下电泳，打开电源开关，调节电压为100伏，电泳时间1hr。电泳后，调节旋钮使电流为零，关闭电泳仪切断电源。醋酸纤维薄膜电泳装置示意图1.滤纸桥2.电泳槽3.醋酸纤维素薄膜4.电泳槽膜支架5.电极室中央隔板（三）电泳

电泳完毕后将薄膜取下,用剪刀剪出个性小口（标记用），直接浸于氨基黑10B的染色液中，染2min取出。将薄膜从染色液中取出后用水冲洗后，依次在第一、第二、第三漂洗液中漂洗，最后再用清水漂洗一遍，直至可清晰分辨出5条色带。风干或晾干。血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱示意图（四）染色与漂洗

漂洗完毕后将薄膜取出,放在滤纸上。将薄膜上的5条色带根据其颜色深浅、形状、大小及相对位置进行描述、记录在实验报告本上，并判断分析其结果。

注意事项：

薄膜和铅笔画示意图均要提供，需要标示每条染色后条带的名称，并讨论说明判断原因。

（五）记录和分析实验结果六、注意事项1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。2、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，

吸水量以不干不湿为宜。3、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏

膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。4、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过

多或过少。5、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且

点样面向下（为什么？）。6、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间

太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要

时可进行复染。临床意义

血浆蛋白是血浆中最主要的固体成分,含量为60～80g/L,绝大部分由肝脏合成,仅γ球蛋白由浆细胞合成,正常值:白蛋白57%—72%α1球蛋白2%—5%α2球蛋白4%—9%β球蛋白6.5%—12%γ球蛋白12%—20%

血浆蛋白的主要功能:

维持血浆胶体渗透压

调节血浆p