科研设计与统计

袁秉祥（西安交通大学医学院药理学系）82657724;ybx@科研选题,实验设计和数据处理科研思路和选题创新第一节创新创新创新一、顺向外展（uni-directionalextrapolation)1、沿最新发现,思路,观点,方向提出2）应用型、侧向型或枝节性课题（新颖性）1）主导性、前沿性、深入性课题（更快,更高）2、沿着自己研究室的工作积累和长期坚持的研究方向提出更深入、更全面的课题。3、经过国内外的技术合作、学习进修、攻读学位，将参与的课题延伸或扩展，提出新的的课题。4、通过学术交流（特别是国际学术会议）获得最新、最全面的科研信息，综合分析后提出新问题。开辟新的方向和引导世界跟踪5、技术引进，填补空白二、逆向外展（reverseextrapolation）1、以一定线索为依据，对传统理论、观点提出有根据的疑问，并向相反的方向推论，进而开创出新的研究领域，开创新的方向。缺血损伤研究抗缺血研究缺血再灌注损伤缺血预适应保护缺血后适应保护灌注治疗短时间缺血舒张血管抑制血栓血液流变抗动脉硬化降低耗氧和代谢（耐缺氧）抑制调亡介入和手术药物性保护2、通过偶然机遇、意外发现，对传统观点提出疑问，进行反向思维，进而开创出新的研究领域。提出疑问→内皮细胞→

EDRPs→NO→心血管,免疫和神经功能┄┄→1998年生理与医学Nobel奖血管内皮损伤血管内皮完整RobertFFurchgottLouisJIgnarro,FeridMurad三、交叉扩展（acrossextrapolation）1、学科借鉴原油管道输送┄┄┄┄┄→血液流变学2、学科交叉生物学+信息学┄→生物信息学数学+医学┄→数学药理学，数学生理学…医学+心理学┄→医学心理学医学+社会学┄→吸烟、酗酒，药物成瘾医学+药学┄→临床药学3、临床-基础医学交叉从临床寻找实际问题；从基础寻求技术和理论突破；基础-临床结合解决重点或重大问题。实验设计第二节根据研究目的、工作积累和研究条件，查阅相关文献，进行学术研讨，充分掌握相关理论和技术方法，提出关键问题，然后进行实验设计。

重复、随机、对照

一、实验设计的基本原理和原则实验设计实验设计原则1.重复（replication）

结果应稳定重复，尽量增加例数，减少实验误差：抽样误差偶然因素对抽样的干扰，使总体不同质。均衡随机，样本足够。条件误差实验条件（时间、环境……）不均衡所致。同步平行观察。系统误差实验平台、测定标准和习惯造成的单向偏差。提高实验条件和学科水平。过失误差研究者和被研究者的主观意愿、精神因素干扰了研究结果。严密的实验设计，如双盲法设计。实验设计随机目的是把一切干扰因素均衡地分配到各组（实验组和对照组）中，避免主观因素和实验误差的影响。获得随机数字……进行随即分组。在实际工作中常采用均衡随机进行分组，即先将可控制因素（如性别、体重、病情、病程……）进行分层，然后在每一层次中再进行随机分组。2．随机（randonmization）

实验设计实验设计原则对比的结论是：有无显著性意义或是否具有生物等效性。对照分为阴性对照（或称空白对照）和阳性对照，对照应是在同时、同地、同条件下进行，使对照组具有可比性。3．对照（control）

对照就是研究，是科研对比的基础，只有对比才能得出统计学的结果和研究结论。实验设计实验设计原则

┌正常组对照（假手术组）

对照组┤模型组对照*

└阳性组对照

┌小剂量

实验组┤中剂量

└大剂量

通常以模型组对照为对照组阴性组对照二、分组对照设计实验设计分组对照设计以机体（动物、病人、标本）自身作为对照的配对资料，即在同一个体上观察处理前后的变化。如同一标本（血样、尿样）用2种检测方法的结果比较，一批病人两个疗程的比较。

给药前A——→∣给药后A’

┌A1——→∣给药后A1’

└A2——→∣给药后A2’AS1.单组自身比较设计分组对照设计实验设计☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺(n=20)☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺(n=20)1个疗程2个疗程☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺☺(n=20)有效率=50%有效率=60%配对t检验泊松分布关联x2和优势x2正常对照组A——→*模型对照组B——→阳性对照组C——→实验组（1）D——→

实验组（3）E——→

实验组（10）F——→

2．单纯平行对照实验设计分组对照设计量反应：单因素（组间）方差分析→两两对比（t、t´或q、q´

检验）最常用、最简单的设计；实验组和对照组同步开始，同步结束。（对比组）∣∣∣∣∣∣质反应：x2检验量效关系的显著性检验（tr）实验组和对照组同步开始，多次测量，同步结束，如：给药前、给药后10、30、60、120min、…。给药前给药后

对照组A―→。―→。―→

。―→∣

实验组B―→。―→

。―→

。―→∣

3．多次测量平行对照数据处理：多次测量的方差分析→两两对比(t,t´或q,q´检验)实验设计分组对照设计如给药前数据已有差异，应进行数据转化，用变化（差值）或变化率表示。某些研究和测定无法做到同时同地完成，经常需要跨时间、多中心完成；但在数据处理时应注意批间和顺序变异。

对照组A∣∣∣实验组B∣∣∣对照组A实验组B对照组A实验组B对照组A实验组B第一批第二批第三批第1段第2段第3段4．平行分批分段对照实验设计分组对照设计不可将多批数据综合一并处理，而应求出批间变异进行析因处理：析因t检验；方差分析临床研究中先将可控因素（如性别、体重、病情、病程……）进行分层（如3个层次），然后在每一层次中再进行随机分组。1层∣2层∣

3层∣

1层∣

2层∣

3层∣

对照组实验组5.平行分层对照（均衡随机）实验设计分组对照设计多因素方差分析，按平行对照处理，t、t´（q、q´

）检验。交叉对照设计适合于动物或病人状态稳定，刺激或药物作用后可恢复到原来状态，如自发性高血压大鼠和二期高血压病人对降压药的作用。在进行相对生物度测定时，通常采用这种交叉配对设计。1)一次交叉（AOB，BOA）：交叉配对设计

A:对照组∣清洗期B:对照组∣

B:实验组∣（7t1/2）

A:实验组∣6.交叉对照实验设计分组对照设计所得数据可进行显著性检验或生物等效性分析（采用双向单侧t检验）。ABC

ABCDABCDE

ABCDEFBCABCDABCDEABCDEFACABCDABCDEABCDEFAB

DABC

DEABCDEFABC

EABCDEFABCDFABCDE3×34×45×56×62）多次交叉（拉丁方设计）实验设计分组对照设计拉丁方设计巧妙合理，同一病例、动物和标本可多次使用，所需例数较少，消除了用药顺序影响和个体差异的干扰，统计效率很高。拉丁方设计特别适于病情和模型稳定的珍贵病例或动物的研究。缺点：实验周期成倍延长，方差分析数据库稍复杂。6、多因素多水平实验设计正交设计（orthogonaldesign)均匀设计（uniformitydesign)权重配方法（weightedmodificationmethod）参数法（parametermethod）映射法（refectionmethod）正交t值法（orthogonalttest)综合指数法（comprehensiveindexmethod）等效线法（Loewe）合并指数法（Chou-Talalay）实验设计多因素多水平设计1）正交设计(Orthogonaldesign)以严谨而巧妙的分组安排来分析多因素多水平的资料●均衡分散：试验点在试验范围内排列规律整齐●整齐可比：试验点在试验范围内散布均匀。●L是正交设计表的符号，例如L4表示4种组合，L4(23)表示3种因素各2个水平。L4(23)正交表的代号试验次数因素的水平数因素数实验设计多因素多水平设计3因素2水平，用正交表需要安排L4(23)=4组试验；5因素5水平，用正交表需要安排L25(55)＝25组试验。组合实验组合安排实验次数及结果Ca2+K+Mg2+123合计A1(高）1(高）1(高）8.6B1(高）2(低)2(低)2.0C2(低)1(高）2(低)9.7D2(低)2(低)1(高）3.0Z1(1水平和)14.818.317.611.111.311.133.5Z2(2水平和)18.715.215.9D(Z1-Z2)-L4（23）三种营养液成分实验设计及其数据处理Ca2+的|D|最大，说明Ca2+对实验结果影响最大，且低浓度效果最好；K+影响次之，高浓度效果好；Mg2+影响小，高浓度效果好；结论是：低Ca2+、高K+和高Mg2+为最佳组合。多因素多水平设计

2）均匀设计(Uniformitydesign)1978年，七机部由于导弹设计提出了一个五因素大于10水平的试验要求，而试验总数不超过50，显然优选法和正交设计都不能做到，方开泰与王元经过几个月的共同研究，提出了“均匀设计”试验设计用于导弹设计，并取得了成效。排列组合53＝125次试验73=343次正交设计52＝25次试验72=49次均匀设计5次试验7次每个表有一代号Un(qs)，U表示均匀设计，n次试验，每个因素有q个水平，s表示最多因素数，即最多有s列，其中n=q。设计表U6表示有6个因素（如联用药物），做6次试验，每个因素有6个水平（如剂量水平），该表有6列，见表1均匀设计表符号表示的意义U7(76)均匀表的代号试验次数因素的水平数因素数

3）权重配方法（weightedmodificationmethod）孙瑞元教授利用均匀设计和优化（或超级）拉丁方设计原理，并根据复方药物量效关系规律，建立的数据分析方法和科学、高效、简便的新药组方方法。权重配方法进行规范的多比例、多剂量的优选实验设计与优化研究手段。

均匀设计+优化拉丁方设计6543216个组分药配伍组1配伍组2配伍组3配伍组4配伍组5配伍组66个剂量组123456U6(66)均匀设计+6×6拉丁方设计配伍组1配伍组2配伍组3配伍组4配伍组5配伍组66543211236个剂量组3个组分药3个组分药及其18个剂量在6个配伍组中的均匀分布U6(66)均匀设计+3×3拉丁方设计42只♂SD大鼠正常对照组(6只)给药组(36只)1ml/100g10d

11(3)28(6)

8(2)20(5)6(1)15(4)

7(2)11(4)20(6)5(1)9(3)15(5)

9(1)12(2)16(3)21(4)27(5)36(6)123456双密达莫(D3)(mg/kg)亚硒酸钠(D2)(μg/kg)塞来昔布(D1)

（mg/kg）配伍组量效数据：三药配伍对血栓指数Q影响，E为1/Q均数，SD标准差各组分在配伍组中的剂量联用药效配伍组别

组分1

组分2

组分3ESD1

9

7

110.0700.01021211

280.0780.01531620

80.0730.021421

5

200.0690.010527

9

60.0650.01863615

150.0710.010Emax0.093Dmax36.0020.0028.00DEmax12.0011.0028.00DEmin27.009.006.00

标化剂量

b(di)b(didj)P值优化剂量优化剂量注释和相互作用定性结果组分1d1-0.067--0.07112.000为组分1DEmax组分2d21.811--0.03720.000为组分2Dmax组分3d31.853--0.01128.000为组分3Dmax主药交互项d3d1---0.3050.14312.000为组分1剂量,两组分间呈相加性交互项d3d2--2.3710.07911.000为组分2剂量,两组分间呈相加性组分重要程度组分3>组分2>组分1理论优化组方组分1剂量12.000组分2剂量15.500组分3剂量28.000(注:若同组分获得不同两剂量,则取其均数)理论优化比例组分1:组分2:组分3=1.00:1.29:2.33

各组分在组方中的作用及其相互作用

（DAS软件）5）权重配方分析结论①复方塞来昔布抑制血栓形成，双密达莫作用明显(权重指数b=1.853，P<0.05)，②亚硒酸钠作用也较明显（b=1.811,P<0.05）；③塞来昔布对血栓形成具有潜在危险性(b=-0.067),且与双密达可能相互拮抗(b=-0.305,P=0.143)④理论优化组方为塞来昔布12mg/kg+亚硒酸钠16μg/kg+双密达莫28mg/kg,三者的理论配伍比例为：1:0.0013:2.3。排列组合53＝125组73=343组正交设计52＝25组72=49组均匀设计5组7组权重配方设计6次试验4、正交t值法(Orthogonalttest)中药复方药味数较多，分析主药、辅药，找出最佳组合及最优剂量是中药组方定量分析的出路。孙卫民和孙瑞元教授根据中药方剂研究特点，按正交设计原理及F值与t值的特定关系，提出了正交t值法。例如研究由10味中药组成的方剂分析中，利用正交t值的原理进行设计，其统计用F检验。

①分组：AB

A

B2A2B

*协同AB>2A,>2B

*相加AB>A或B

*拮抗AB<A或B

②分组：ABCABBCACABC2A2B2C

*协同ABC>A+B+C;AB>2A，2B;BC>2B，2C；……

*相加A+B+C>ABC>A、B或C;A+B>AB>A或B；B+C>BC>B或C;……

*拮抗ABC<A、B或C;AB<A或B;BC<B或C5）拆方设计实验设计拆方设计通常药物的实验剂量需要通过预实验摸索求得，或通过查阅资料获得。经常以mg/kg或g/kg作为剂量单位，人与动物之间，不同种属动物之间的剂量呼应关系应按体表面积来计算。还应注意药效学研究与毒理学研究，临床前研究与临床研究之间的剂量呼应关系。剂量设计关系到实验的成败。四、剂量设计实验设计剂量设计小鼠20g大鼠200g豚鼠400g兔1.5kg猫2.0kg猴4.0kg犬12kg人70kg小鼠20g1.07.012.2527.829.7

64.1124.2387.8大鼠200g0.141.01.717.856.0豚鼠400g0.080.571.09.231.5兔1.5kg0.040.250.441.01.082.44.514.2猫2.0kg0.030.230.410.921.0猴4.0kg0.020.451.01.96.1犬12kg0.0080.030.521.03.1人70kg0.00260.0180.0310.070.0780.160.321.01.按体表面积比率换算等效剂量（标准体重）

实验设计剂量设计

从表中动物与人体表面积比值，直接计算标准体重的人或动物的剂量。如大鼠剂量是50mg/kg，推算人的试用剂量。200g体重大鼠的剂量10mg，那么体重为70kg人的总剂量为10×56＝560mg，人的剂量为560÷70＝8mg/kg。规律：动物越小，剂量（/kg）越大。实验设计剂量设计

2.体型系数估算法实验设计剂量设计在动物和人的体重与标准体重相差较远时用下列公式剂量：DB为欲求算动物剂量，DA是已知动物剂量，WA和WB分别是它们的体重。RA和RB分别是它们的体重系数，各种动物和人的体型系数见下表：种属小鼠大鼠豚鼠兔猫猴犬人R0.060.090.0990.0930.0820.1110.1040.11非标准体重实验设计剂量设计如大鼠（200g体重）的有效剂量是50mg/kg，推算45kg人的试用剂量：45kg体重人的估算总量是10×45=450mg，为了更安全，取其1/5～1/3做为临床研究的初试剂量（100mg)。人、各种动物之间的剂量不同，动物的体重越小,剂量（/kg）越大。动物和人的剂量比例关系（按／kg计算）如下：3.粗略估算法实验设计剂量设计人犬猴猫兔豚鼠大鼠小鼠12-33-55-77-99-111）临床前药效学剂量：一般在同种动物LD50的1/10至1/50之间。2）人的首次试用剂量：①一或二种动物LD50的1/600或ED50的1/60～1/10；②长期毒性试验引起可逆性不良反应剂量的1/60；③相当于犬最大耐受剂量的1/10～1/5。④按体表面积折算，用药效学有效预测剂量的1/5。4.根据ED50、LD50、最大耐受量来换算实验设计剂量设计1）以成人剂量估算：用最小分布容积确定最大浓度成人剂量/血液总量（4.5L)=最大实验浓度（脱水药）成人剂量/体液总量（15L)=最大实验浓度2）以动物实验有效剂量来估算：动物实验有效剂量/（体重/4）=最大实验浓度3）以血药浓度（阈浓度）为实验浓度4）常用实验浓度：10-93×10-910-83×10-810-73×10-710-63×10-6

10-5mol/L离体试验浓度（mol/L）估计方法实验设计剂量设计数据处理第三节1、统计学2、量效关系C-T曲线数据处理显著性优效性等效性非劣性量反应-受体动力学质反应-机率单位法

3、药动学房室模型判断消除动力学参数计算：t1/2(α)、t1/2(β)

、

k10、k12、k21、CL、Vd、F、AUC

累积动力学参数计算：Css、CssCss(max)、Css(min)、生物利用度的等效性研究群体动力学研究PK/PD研究非线性动力学量效曲线显著性界值显著性S-δ

significanceTS+δS优效性superiorityS+δST药效学统计数据处理等效性界值非劣性等效性S-δTnoninferiorS-δS+δSSequivalentT药效学统计数据处理单率述描泊松分布或二项分布法（可信限区间）两率对比无配对关系构成比相同例数≥3χ2（2×2）例数<3直接机率法构成比不同χ2权重法有配对关系关联χ2法＋优势χ2法多率对比有等级顺序等级序值法、Ridit法无等级顺序多率综合对比χ2（R×C）组间两两对比χ2（2×2）一、统计学计数资料（质反应）数据处理两均数对比常态分布(参数资料)无配对关系方差整齐t值法方差不齐t´检验有配对关系配对t值法偏态分布（非参数资料）秩和检验，序值法等效性检验双向单侧t检验多均数对比多组对比单因素方差分析+两两对比多因素分析方差分析多批资料析因t值法,方差分析两两对比t、t´或q、q´检验拉丁方设计方差分析二、计量资料（量反应）数据处理〖例1〗药效学研究：对照药为100±8(n=10)；新药为94±7(n=10)。判断差异性和等效性。1）计算2组标准误：Se＝3.36；2）差异性判断：t=｜100-94｜／3.36=1.79，P＞0.05，无显著意义。3）等效性判断：查表或计算得T=1.734，等效判断标准D=0.1，等效界值：L＝0.1×100－1.734×3.36＝4.17均数差绝对值为6，大于L值，故等效性不合格。可见t检验P＞0.05，并不能说明两药等效。〖例2〗药效学研究：对照药为60±2（n=20），新药为64±3（n=20），判断差异性和等效性。1)两组标准误，Se=0.81。2)差异性判断：t＝(｜60-64｜)／0.81=4.94，P＜0.01，差异有非常显著性意义3)等效性判断：L＝0.1×60-[1.644+1.55／(38-0.75)]×0.81=4.64均数差绝对值（4）小于L值（4.64），故等效性合格，可见t检验P＜0.01，并不拒绝两药等效。

量效关系显著性检验t(r)检验散点回归得回归系数(r)，n为散点数

数据处理自由度=n-2谢谢！六、量-效关系设计和受体动力学量效曲线量效实验曲线直线化量反应（Scott比值法）质反应（Bliss法）直线直线回归回归参数量反应KD,EmaxLD50,ED50质反应实验设计量-效关系

1.量反应：效应以可测量的连续变量表示（x±S）

┍纵坐标┍效应直方双曲线

量效曲线┤┕浓度/效应对称s形

┕横坐标┍普通剂量或浓度直线（Scott法）

┕对数剂量或浓度

EEC/E

ClgCC

E＝─────·Emax10log[D]KD＋10log

E[D]───＝─────EmaxKD＋[D][D]1KD──＝＝───[D]＋───

E

EmaxEmax实验设计量-效关系

纵坐标（效应）累加反应数或率量效曲线机率单位

横坐标（剂量）普通剂量对数剂量Bliss’s法实验设计量-效关系2.质反应：可进行率的对比，反应频数纵坐标（效应）反应频数或率横坐标（剂量）普通剂量对数剂量量效曲线偏态分布曲线正态分布曲线长尾s形曲线对称s形直线举例：竞争性拮抗

阿托品阻断M受体对Ach肠管收缩量效关系的影响

Ach[D]3×10-810-73×10-710-63×10-610-53×10-5104阿托品[A]0mol/L72040627310-8mol/L08184458723×10-8mol/L0051647647410-7mol/L000927456571

E

1

2log(R-1)-lg[A]pA2.C.实验设计.量-效关系lgC

pD2和pA2的计算：

log(R-1)=-(-log[A])+(-logKA)

第一步：求出R1、R2、R3直线回归求出未加阿托品前Ach的KD0；同样求出加入阿托品后Ach的KD1、KD2和KD3，求出R1、R2，R3：R1=KD1／KD0

第二步：计算pA2值输入3组X、Y数据组：y=log(R-1)，x=-log[A]；计算X的理论值[0][x]，求得pA2。实验设计量-效关系

非竞争性拮抗

麦角酸二乙胺非竞争性拮抗5-羟色胺犬离基底动脉条收缩作用EAmaxEABmaxLSD（mol/L）010-103×10-1010-93×10-9

5-HT效应（Emax）16mm13mm11mm8mm6mmR(EAmax／EABmax)1.23081.454522.6667-log[B]

x109.522998.5228log(R

-1)y-0.6368-0.342400.2218实验设计量-效关系

Emax50%EmaxEClog(R

-1)-log[B]pD2’....log(R-1)=-(-log[B])+(-logKB)输入4组x、y数据组，x为-log[B]，y为log(R

-1)，直线回归，取回归参数和计算pD2'，计算X的理论值[0][x]，求得pD2’实验设计量-效关系实验设计七、药动学研究设计血药浓度C-T曲线临床血药浓度监测指导临床合理用药（剂量、给药速度、联合用药）临床生物等效性研究药动学研究设计房室模型线性模型动力学模型PK/PD模型给药途径和剂型机体状态微分方程→指数方程→直线方程基础药动学临床药动学1）显著性检验（significancetrial）显示试验药的效应是否不同于对照药或安慰剂。2)优效性检验（superioritytrial）显示试验药的效应是否大于对照药或安慰剂。3）等效性检验（equivalencetrial）确认药物效应差别无重要意义，即试验药与阳性对照药在效应上相当。4）非劣性检验（noninferioritytrial）显示试验药的效应不小于阳性对照药。临床药效学统计数据处理显著性界值显著S-δ

significanceTS+δS优效superiorityS+δST药效学统计数据处理等效性界值非劣效等效S-δTnoninferiorS-δS+δSSequivalentT药效学统计数据处理实验设计和数据处理

袁秉祥（西安交通大学医学院药理学系）82657724;ybx@

正交设计以严谨而巧妙的分组安排来分析多因素多水平的资料，可以分析出哪个因素是主要因素，哪个因素是次要因素；哪个因素起独立作用，哪些因素有相互影响。正交设计使得方差分析的计算过程比一般方差析因分析简便明确，应大力提倡。1.正交配方设计实验设计注意：用正交设计选出最佳组方后，应继续做确认性药效试验，以确定药物效应和相互作用。三、药物相互作用和配方设计配方设计另章论述

例1：L4（23）设计，L是正交设计的符号，L4表示4种组合，23表示3种因素各2个水平。

营养液中的三种成分：Ca2+、K+、Mg2+，各有2个水平（高、低浓度），分析各成分的影响和相互作用，找出最佳组合。实验设计配方设计例1：L4（23）实验设计及其数据处理组合实验组合安排实验次数及结果Ca2+K+Mg2+123……合计A1（高）1（高）1（高）8.6B1（高）2（低）2（低）2.0C2（低）1（高）2（低）9.7D2（低）2（低）1（高）3.01水平和(Z1)14.818.317.633.52水平和(Z2)18.715.215.9差值D(Z1-Z2)-实验设计配方设计Ca2+的|D|最大，说明Ca2+的浓度变化对实验结果影响最大，且低浓度效果最好；K+影响次之，高浓度效果好；Mg2+影响小，高浓度效果好；结论