检测NK细胞活性的方法

中国专利奖推荐项目介绍（发明/实用新型）专利号：ZL201410005008.7专利名称：检测NK细胞活性的方法申报单位：推荐单位：二〇二〇年九月十八日国家知识产权局制

一、申报项目基本信息专利号ZL201410005008.7专利名称检测NK细胞活性的方法专利权人王昭发明人王昭；张嘉；王旖旎；王晶石；吴林IPC主分类号IPC主分类号可通过国家知识产权局网站查询。G01N21/64通讯地址/邮编联系人1王昭手公电子邮箱zhaowww263@联系人2手机办公电话电子邮箱推荐单位

二、专利质量评价材料评价“三性”和“文本质量”,说明参评专利质量的优秀程度（一）新颖性和创造性：列出若干个申请日之前最接近的技术，简要介绍其技术方案；并详细说明未对参评专利的新颖性和创造性构成实质性影响。NK细胞活性是判定机体抗肿瘤、抗病毒感染及免疫调节功能的重要指标之一。51Cr释放法被认为是NK细胞活性测定的“金标准”，但此方法检测成本高，且具有放射性污染，不宜普遍开展。而LDH释放法虽然操作简便，但易受时间和温度的影响，稳定性差，且要求受检单个核细胞的数量较多，造成采血量增加以及严重血细胞减低的患者检测失败。流式细胞术作为一种新型的NK细胞活性测定方法，近年来得到越来越广泛的关注。但目前各种流式测定方法存在检测结果易受非特异性染色、荧光易丢失等因素影响。虽然前期公开存在各类NK细胞活性的检测方法，但由于各种检测方法均存在自身缺陷不足及操作条件的限制，仍缺乏一种可广泛应用及临床推广的可靠稳定的NK细胞活性的检测手段。因此，临床上对于某些危重疾病的早期诊断仍面临很大挑战。那么，建立一种稳定、准确、直接、操作易行性强的检测NK细胞活性的方法日渐凸显其迫切性，是本领域技术人员一直存在并亟待解决的技术难题。基于上述问题，为克服上述前期NK细胞活性检测方法的不足，本专利研发建立了转染荧光细胞株联合流式细胞术测定NK细胞活性技术，采用稳定表达EGFP的长期传代靶细胞株，并采用AnnexinV-PE/7AAD双染色标记不同状态靶细胞所占比例，并能直观精准的反映NK细胞的杀伤活性，从而提高检测的准确性和成功率，并且宜于临床推广应用。主要新颖性及创造性如下：1.本专利技术创新采用慢病毒转染技术成功构建稳定表达EGFP的转染靶细胞株，使其能够长期稳定传代培养，与瞬时转染相比，克服了细胞长期传代后EGFP大量丢失的情况，保证了该检测方法的长期稳定性；同时省去了预先进行细胞染色或抗体标记的冗繁过程，也避免了非特异性染色以及标记效/靶细胞所造成的细胞功能影响，从而提高检测结果的准确性及检测效率。2.采用AnnexinV-PE/7AAD双染色标记细胞凋亡，具有特异性细胞染色功能，能够计算出靶细胞各阶段不同状态(活细胞、早凋、晚凋及坏死细胞)所占比例，与单纯使用核酸染料碘化丙啶(PI)染色仅能标记死亡细胞相比较，能够更全面、直观、精准地反映NK细胞杀伤活性。3.将流式细胞术与EGFP荧光细胞株相结合用于NK细胞活性检测，该创新克服了传统检测技术的放射性污染(51Cr释放法)以及粗略性(LDH释放法)的局限，敏感性及再现性强，并且对受检者抽血量明显减少，降低白细胞缺乏患者检测失败率，能大幅提高NK细胞活性检测的准确性和适用性。该技术的显著优点如下：①检测方法灵敏度提高：在判定原发性HLH的效能方面，采用该项技术测定NK细胞活性的研究数据表明，ROC曲线下面积(AUC)为0.872，Youdenindex最大时对应的敏感度为84.21%，特异度80.67%。②需采血量少：当检测血液中NK细胞的活性时，所需的血量大大减少，并且经过试验证明，本发明的检测方法用于检测血液中NK细胞的活性时，抽血量为传统技术(51Cr释放法、LDH释放法、MTT比色法)的25%。③本技术不需要放射性物质，因此不存在放射性污染。④检测时间短。本技术的检测时长仅为2-4h，大幅度节省了人力和物力资源的投入。综上所述，本技术创新具有准确度高、灵敏度高、样品所需量小、无放射污染、检测效率高等诸多优点。该技术创新图示如下：①荧光显微镜下观察EGFP-K562细胞的凋亡情况，活细胞仅发出单一绿色荧光，凋亡细胞可被膜荧光染料AnnexinV-PE着色同时发出黄色荧光，细胞膜完整性被破坏的晚期凋亡及坏死细胞可被核酸染料7AAD着色发出红色荧光。早期凋亡EGFP-K562细胞（低倍10×10）晚期凋亡及坏死EGFP-K562细胞（高倍10×40）②流式细胞术检测NK细胞杀伤活性结果示意图单纯EGFP-K562细胞自然凋亡背景正常人NK细胞的杀伤活性HLH患者NK细胞的杀伤活性（二）实用性：结合实施情况，说明参评专利的技术方案能够制造或使用，并已产生了积极的效果。1.该专利技术成果被第30届国际组织细胞学会议(30thHS,2014)选为大会发言《THESIGNIFICANCEOFANEWMETHODOFNKCELLACTIVITYBYFLOWCYTOMETRYINTHEDIAGNOSISOFADULTHEMOPHAGOCYTICSYNDROME》进行汇报交流。研究成果相关论文《Applicationofanimprovedflowcytometry-basedNKcellactivityassayinadulthemophagocyticlymphohistiocytosis》于2017年发表在\o"Internationaljournalofhematology."IntJHematol.期刊杂志2017;105(6):828-834，系列相关研究论文分别发表在2019年ClinImmunol.期刊和2020年OrphanetJRareDis.期刊。2.该专利检测技术被纳入《HLH诊治中国专家共识》中作为推荐检测方法“关于NK细胞活性的检测方法，国内外没有统一的规定，推荐使用荧光细胞构建与流式细胞技术相结合的手段检测NK细胞杀伤活性方法。”——摘自《噬血细胞综合征诊治中国专家共识》(噬血细胞综合征中国专家联盟,中华医学会儿科学分会血液学组.噬血细胞综合征诊治中国专家共识[J].中华医学杂志.2018,98(2):91-9)3.该项发明专利技术作为噬血细胞综合征(HLH)快速诊断中的一项重要技术，荣获2017年度北京市科学技术三等奖(2017医-3-009-04)，2018年度华夏医学科技奖二等奖(编号：201802039U0201)，2019年度北京医学科技奖二等奖（编号：201902004）和2020年度“金桥奖”二等奖。4.目前已成功举办五届“全国HLH相关实验室检测培训班”，推广转染荧光细胞株联合流式细胞术测定NK细胞活性技术，来自全国20多个省近500名实验技术人员参加培训。该项发明专利技术在全国多家三甲医院开展了技术推广及应用，并出具应用证明。5.该项发明专利技术成果连同其相关专利技术目前已成功实现科技成果转化签约。6.以该项专利技术为依托，获得科研项目如下：①首都卫生科研发展专项(自主创新转化项目2016)：转染荧光细胞株联合流式细胞术测定NK细胞活性的新技术及其临床应用；②北京市医管局“扬帆”计划（临床技术创新项目2018）：NK细胞功能性检测用于快速诊断噬血细胞综合征的临床研究。7.该项专利技术及相关内容被多家网络及视频媒体(搜狐网、丁香园、华医网等)进行报道：①搜狐网：北京友谊医院血液科领衔的科研项目获北京市科学技术奖励三等奖/a/222160295_100443，；②丁香园：专家访谈|北京友谊医院王昭主任谈噬血细胞综合征-丁香园/article/582271；③华医网：/cme/contents/30/21048.html；④搜狐网：/a/274951466_685811。三、技术先进性评价材料（一）技术原创性及重要性：结合技术要点，说明参评专利属于基础型的专利或改进型专利，并解释是否解决了本领域关键性、共性的技术难题。本发明专利基于流式细胞术、稳定传代荧光标记细胞、特异性染色技术，实现NK细胞活性的实时精准检测，以克服目前检测技术的局限性。1.目前流式细胞术多采用基因转染方法使靶细胞特异性表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)，这种瞬时转染技术存在多次传代后EGFP大量丢失的情况，因而影响检测结果，难以保证实验的长期性。本专利在研发过程中，构建了携带绿色荧光蛋白(EGFP)目的基因的慢病毒质粒载体并包装形成慢病毒，然后用上述慢病毒侵染K562细胞，将目的基因整合到靶细胞的基因组中，并筛选得到一株稳定表达EGFP的单克隆K562细胞系，使其能够长期稳定传代培养。解决了靶细胞稳定表达荧光蛋白的技术难点，保证了检测结果的可靠性，并易于保存和转运。2.目前用于凋亡细胞标记的染色剂PI仅能标记晚期凋亡及坏死细胞，故无法反映NK细胞对靶细胞杀伤的早期凋亡。本专利采用AnnexinV-PE/7AAD双染色标记细胞凋亡，能够计算出靶细胞各阶段不同状态(活细胞、早凋、晚凋及坏死细胞)所占比例，将那些处于早期凋亡阶段(传统方法无法体现)的细胞明确标记，可以更全面、直观、精准的反映NK细胞的杀伤活性。因此解决了现有检测手段难以对NK细胞实际杀伤能力进行评估的技术难点。3.该创新克服了传统检测技术的放射性污染(51Cr释放法)以及粗略性(LDH释放法)的局限，敏感性及再现性强，并且对受检者抽血量明显减少，降低白细胞缺乏患者检测失败率，能大幅提高NK细胞活性检测的准确性和适用性。（二）技术优势：１．对比若干个当前（参加评奖时）的同类技术，详细说明参评专利在提高效率、降低成本、节能减排、改善性能、提升品质等方面的技术优势和不足。２．结合实施情况，相对于公开的技术方案，说明参评专利技术实施效果的确定性。该专利检测技术与目前各类技术相比具有以下优点：1.通过细胞转染使靶细胞本身可以特异性表达荧光蛋白，从而省去了每次实验前需预先进行细胞染色或抗体标记的冗繁过程，提高了检测效率；同时也避免了非特异性染色结果不准确的问题，避免了共孵育前标记靶细胞影响靶细胞功能的问题，提高了检测的精准性。2.本检测方法不需要放射性物质，因此，不存在放射性污染。3.检测时间短：本专利检测方法的检测时长约为2-4h，而传统技术（LDH释放法、MTT比色法等）的检测时间需要18-24h，由此可见，本专利技术大大缩短了检测时间。4.由于本检测方法灵敏度提高，因此，当检测血液中NK细胞的活性时，所需的采血量大大减少，并且经过试验证明，本发明的检测方法用于检测血液中NK细胞的活性时，抽血量仅为传统技术（51Cr释放法、LDH释放法等）的1/4，降低了白细胞缺乏患者检测失败率，能大幅提高NK细胞活性检测的适用性。综上所述，本检测方法具有检测全面、准确度高、灵敏度高、检测效率高、样品所需量小等诸多优点。（三）技术通用性：1.介绍参评专利目前已应用的领域和范围；2.说明该专利技术还可以应用的其他领域和范围。以上材料不超过2500字。1.目前应用领域范围：噬血细胞综合征(HLH)是一种危及生命的高炎症因子状态，若不能及时诊断并给予恰当的治疗，病死率极高。而NK细胞活性是早期确诊HLH的重要指标，准确测定NK细胞活性的变化是诊断疾病、选择治疗方式以及随访疗效的关键环节。噬血细胞综合征(Hemophagocyticlymphohistiocytosis,HLH)是一种以T淋巴细胞和巨噬细胞活化的失控以及炎性细胞因子过度生成为特征的免疫紊乱状态。活动期的HLH病情进展迅速，若不及时进行合理、有效的干预治疗，死亡率极高。因此，若患者在疾病早期能够得到及时准确的诊断，积极给予恰当的治疗，可以改善生存，降低病死率。HLH的病理生理基础为细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的下调和NK细胞功能的缺陷。NK细胞活性降低是HLH-2004诊断标准中一项重要的检测指标。Janka等发现原发性HLH患者在疾病早期NK细胞活性降低检测率几乎可达100%。另有Spessott等研究证实即使基因筛查为杂合突变也可能导致蛋白功能异常因而确诊为原发性HLH，而这类患者早期NK细胞活性持续降低，这些都说明NK细胞活性的测定对早期正确诊断HLH具有重要意义。越来越多的研究认为，体外检测NK细胞活性是HLH诊断、选择合理治疗方式以及随访疗效的关键环节。目前该专利检测技术已被纳入《HLH诊治中国专家共识》中作为NK细胞活性的推荐检测方法。2.其他应用领域：在实际临床应用当中，NK细胞活性是判定机体抗肿瘤、抗病毒感染及免疫调节功能的重要指标之一，并可在一定程度上判定及监测疾病的发生、发展及预后。例如：在恶性肿瘤、免疫缺陷病、长期使用免疫抑制剂及部分病毒、细菌和真菌感染患者中，NK细胞活性减低；在某些病毒感染性疾病的早期、长期使用干扰素及其诱导物、习惯性流产及宿主抗移植物反应者中，NK细胞活性增高。该专利技术检测NK细胞活性的应用可在一定程度上提高某些危重疾病的早期诊断率，及早得到有效治疗，从而更好地服务于医疗及患者，使更多危重患者的预后得到改善，并从中获益。四、社会效益及发展前景评价材料（一）社会效益状况：详细说明参评项目对促进技术进步、提高科学管理水平、保护自然资源与生态环境、消除公害污染、安全生产、改善劳动条件、医疗保健、保障国家和公共安全、提高人民物质文化生活水平、引领消费习惯等方面所起的作用。如能采取定量方法说明的均需有具体数字。该项专利解决了目前用于NK细胞活性测定的各种检测手段的局限性（包括放射性污染、白细胞缺乏失败率高、可重复性差、判读不精准等），提高了该技术领域的检测水平，提高了诊断时效，节省医疗资源。具体如下：1.该专利检测方法不需要放射性物质及高昂的设备，因此不存在放射性污染，节省了医疗资源；2.所需采血量减少，抽血量仅为传统技术的1/4，降低了白细胞缺乏患者检测失败率，降低患者多次抽血痛苦，扩大检测的适用性；3