土壤微生物研究方法

专题四土壤-微生物系统研究方法

第一节土壤微生物研究概述一、土壤微生物学的研究对象土壤微生物多样性：土壤微生物过程土壤微生物与环境的关系

（一）土壤微生物的物种多样性土壤微生物的功能多样性土壤微生物的结构多样性土壤微生物的遗传多样性1、土壤微生物功能多样性：

指土壤生态系统中微生物的物种丰富度和均一度，主要从分类学、系统学和生物地理学角度对一定地域内物种的现状进行研究。目前主要通过培养基最大限度地培养各种菌落，由此了解土壤中可培养的微生物种群。

2、土壤微生物的功能多样性

指土壤微生物群落所能执行的功能范围以及这些功能的执行过程，对自然界元素循环具有重要意义如：分解功能、营养传递功能以及促进或抑制植物生长的功能等。目前一般采用底物诱导下的代谢响应模式测算土壤微生物群落的代谢功能多样性。3、土壤微生物结构多样性

指土壤微生物群落在细胞结构组分上的多样化程度，这是导致微生物代谢方式和生理功能多样化的直接原因4、土壤微生物的遗传多样性

是土壤微生物在基因水平上携带的各类遗传物质和遗传信息的总和，这是微生物多样性的本质和最终反映（二）土壤微生物过程土壤微生物是土壤中物质转化的动力：如;固氮作用，硝化作用、反硝化作用、腐殖质的分解和合成

土壤酶与微生物细胞一起推动物质转化（三）土壤微生物与环境的关系

如：全球变暖、森林锐减、土壤退化都与微生物有关。二、土壤微生物研究方法进程

1676年，虎克用自制的单式显微镜观察到细菌个体1897年，毕希纳用无细胞酵母菌压榨汁中的“酒花酶”对葡萄糖进行乙醇发酵成功，从而开创了微生物生化研究的新时代1953年，沃森和克里克发表了关于DNA双螺旋模型，整个生命科学领域进入分子生物学研究阶段，是微生物学发展史上成熟到来的标志。第二节土壤微生物的计数与分析一、培养计数法

根据培养基上所生长微生物的数量来估算土壤中微生物的数量的方法稀释平板法最大或然数法（MPN稀释法）土粒法（一）一般微生物的分离与计数

稀释平板法：

用已知质量的土壤在适量的溶液中搅拌的时候，微生物和土壤分离，这些分开的微生物细胞在营养琼脂平板上生长成为分散的菌落，根据菌落数换算得单位重量土壤中微生物的数量。土壤中微生物的数量很多，因此必须取少量样品制成土壤悬液，然后稀释，使发育在培养皿中的菌落可以很好地分散开最大或然数法（MPN稀释法）

用于一些特殊功能菌的计数，如，硝化细菌和反硝化细菌

假设被测定的微生物在稀释液中均匀分布，并在试管中全部存活，随着稀释倍数的加大，稀释液中微生物的数量将越来越少，直到将某一稀释度的土壤稀释液接种到培养基上培养后，没有或很少出现微生物，根据没有出现细菌的最低稀释度和出现菌落的最高稀释度计算土壤中微生物的数量。稀释度10-110-210-310-410-5生长情况++++++++++++++-++--------读数55420该系列稀释中，所有重复都有生长的最高稀释度的数量指标是5（10-2），出现菌落的最低稀释度指标是2（10-4），则该例的数量指标为542，查重复为5稀释法测数统计表得近似值为25稀释度10-110-210-310-410-5生长情况+++++++++-++---++--------读数54220该系列稀释中，所有重复都有生长的稀释度是10-1，指标是5，后面还有三个稀释度有数字，则将数量指标最后一个数字（2）加到前一个数字（2）即544，由表查得近似值为35如果在所有试管都有微生物生长的稀释度后仍有三个数字，土粒法该法是将供试土壤颗粒，排列在适于某一生理类群微生物生长的选择性固体培养基上，这一类微生物的菌落围绕着颗粒发育起来，由这些颗粒在试样中所占的百分数可以得到这类菌在土壤中的含量及其近似值。（二）、厌氧微生物的分离与计数

充氮厌氧培养法

用真空泵抽去真空干燥器中的空气，用N2、CO2H

或H2代替。在真空干燥器中培养严格厌氧细菌，可得表面菌落。焦性没食子酸吸氧法

利用焦性没食子酸在碱性溶液中能吸收游离氧来创造厌氧环境。二、土壤微生物生物量的测定氯仿熏蒸法根据熏蒸和未熏蒸土壤释放的CO2的量计算生物量。底物诱导呼吸法在土壤中加入容易分解的底物进行培养，根据CO2释放量计算。腺苷三磷酸测定法

通过测定土壤中ATP的量测定土壤微生物量第三节土壤微生物多样性分析

土壤微生物多样性是指土壤生态系统中微生物的物种丰富度和均一度,是调节和维护土壤生态系统功能的关键因素。她包括微生物群落多样性、结构多样性及遗传多样性。研究方法基于培养和分离手段来揭示土壤微生物的群落变化。基于生物指示分子（如磷脂脂肪酸、DNA及RNA）变异模式的土壤微生物多样性一、微生物功能多样性研究方法

指土壤微生物群落所能执行的功能范围以及这些功能的执行过程，如分解功能、营养传递功能等BIOLOG碳素利用法：

是由美国BIOLOG公司于1989年开发成功，最初应用于纯种微生物的鉴定，1991年开始应用于土壤微生物群落功能多样性研究，目前以使用BIOLOGECO（生态板）板最为实惠而受欢迎。基本原理：土壤微生物细胞利用31种碳源进行代谢，以代谢过程产生的酶与四唑类显色物质（如TTC、TV）发生颜色反应的浊度差异为基础，运用独有的显性排列技术分析土壤微生物的代谢特征指纹图谱，反映不同环境条件引起的土壤微生物群落变化BIOLOG测试板含有96个小孔，除对照外，其余孔内分别含有不同的有机碳源和一种指示剂，通过接种菌悬液，根据微生物对碳源利用时指示剂颜色变化差异来鉴定微生物群落功能多样性该法优点灵敏度高、分辨力强无需分离培养纯种微生物，可以最大限度地保留微生物群落原有的代谢特征测定简便，数据读取与记录可以由计算机辅助完成可以连续监测微生物的变化，可批量分析该法缺点特别依赖于群体生理活性，不能监测休眠体，也不能检测那些不能利用BIOLOG碳源底物的群体；如果不能很好地解释一个区系中微生物种类的相互作用如何影响底物的利用情况，很难把这些变化同种类变化联系起来；测定是微生物在与野外环境完全不同的溶液中的代谢活性，因此，也不能确定它的结果能否反映土壤区系的实际代谢情况；二、土壤微生物结构多样性分析磷脂脂肪酸法也称为PLEA法（phospholipidfattyacid法）；磷酸脂肪酸是所有微生物细胞膜磷脂的组分，具有结构多样性和较高的生物学特异性，用磷酸脂肪酸作为标记物来研究鉴别土壤微生物群落结构多样性变化。基本原理PLEA是构成活体生物细胞膜的重要组分，不同类群微生物能通过相应生化途径形成特定的PLEA，使部分PLEA总是出现在同一类群的卫生中，作为区分活体微生物群落生物标记的基础。以此根据脂肪酸的种类及组分比例可鉴别土壤微生物群落结构的多样性变化。该法的缺点很难从种的水平鉴定微生物类群，只能鉴定到属该法依赖于标记脂肪酸，PLEA的组成和浓度可能受土壤微生物生长发育及其外界环境的影响，难以区别死与活的微生物，给微生物群落结构的定性和定量分析带来了一定困难。土壤中PLEA标记物的组成及其稳定性受提取方法、提取条件等因素直接影响三、土壤微生物遗传多样性的分析指土壤微生物在基因水平所携带的各类遗传物质和遗传信息的综合，是微生物多样性的本质和最终反映

基于杂交的分析方法(fish技术)基于PCR（聚合酶链反应，polymerasechainreaction）的分析方法基于PCR（聚合酶链反应，polymerasechainreaction）的分析方法

土壤DNA提取与纯化PCR：PCR能快速特性性扩增任何已知序列，并能将pg水平的DNA混合物中的目的基因扩增到ng、ug、mg级的特异性片段变性处理和分析检测：电泳和酶切海南福山香蕉园土壤微生物多样性分析过程16SrRNA基因扩增转化宿主构建16SrRNA基因文库HhaI酶切构建系统发育树.香蕉地土壤细菌种类多样性分析流程总DNA的提取阳性克隆子进行菌落PCR挑选测序、Blast分析多样性分析16SrRNA基因扩增转化宿主构建16SrRNA基因文库HhaI酶切构建系统发育树4.香蕉地土壤细菌种类多样性分析总DNA的提取阳性克隆子进行菌落PCR挑选测序、Blast分析多样性分析（1）库容coverageC文库的库容计算：（2）Shannon―Wiener指数的计算（3）物种均匀度指数的计算公式（4）物种优势度Simpson指数的计算公式

（5）物种丰富度Margalef指数的计算公式多样性指数计算香蕉园土壤真菌种类多样性分析香蕉园土壤总DNA进行ITS片段扩增筛选阳性克隆子进行菌落PCR选择克隆子测序并比对，构建系统进化树测得序列提交GeneBank香蕉根际土壤样品的DNA含量和DNA纯度比较土壤样品DNA纯度浓度µg/ml干土µgDNA/gOD260/OD230OD260/OD280发病蕉园直接法1.571.760.0960.96间接法1.401.690.2560.51健康蕉园直接法1.631.640.0880.88间接法1.481.780.2110.42香蕉地土壤细菌种类多样性

图4

土壤总DNA的16SrDNA扩增结果本研究采用的PCR循环次数是15次，同时做10管，将PCR产物回收后混合均匀，减少PCR偏向性的影响，以保证所构建的文库准确。香蕉地土壤总DNA16SrDNA片段扩增香蕉园土壤微生物多样性参数表3土样16SrDNA文库的微生物多样性参数文库RFLP库容香农-维纳指数均匀度指数优势度指数丰富度指数编号类型CHEDdmax发病蕉园2196%1.710.560.974.34健康蕉园4793.5%3.590.930.928.87测序结果比对分析表4发病香蕉园土壤16SrDNA文库部分克隆子测序分析编号所属物种E值同源性所属门D1B5Streptomycessp.（链霉菌属）0.0100%放线菌门D1B7Nitrospirasp.（硝化螺菌属）0.096%硝化螺旋菌门D1B11UnculturedAcidobacteriabacterium0.097%未培养酸杆菌门D1B17

Acidobacteriumsp.（酸杆菌属）0.094%酸杆菌门D1B19Unculturedprokaryote0.094%未培养原核生物D1B24

Chloroflexussp.（绿弯菌属）0.095%绿屈挠菌门D1B31Clostridiumsp.（梭菌属）0.099%厚壁菌门发病香蕉园病土壤16SrDNA文库的克隆子有6个属，大约有29%属于厚壁菌门，22%属于放线菌门，还有少部分属于硝化螺旋菌门、酸杆菌门、绿屈挠菌门等。编号所属种属E值同源性所属门D2B006Streptomycessp.（链霉菌属）0.0100%放线菌门D2B007Oscillatoriasp.（颤藻属）0.099%蓝藻门D2B011Clostridiumsp.（梭菌属）0.094%厚壁菌门D2B015Azospirillumsp.（固氮螺菌属）0.087%α-变形菌纲D2B016Sphingomonassp.（鞘脂单胞菌属）0.097%α-变形菌纲D2B022Clostridiumsp.（梭菌属）0.094%厚壁菌门D2B027Nitrospirasp.（硝化螺菌属）0.096%硝化螺旋菌门D2B056Enterobactersp.（肠杆菌属）0.099%γ-变形菌纲D2B064Acinetobactersp.（不动杆菌属）0.0100%β-变形菌纲D2B075Bacillussp.（芽孢杆菌属）0.091%厚壁菌门D2B101Sinorhizobiumsp.（中华根瘤菌属）0.088%α-变形菌纲D2B121Acidobacterialessp.（酸杆菌属）0.097%酸杆菌门D2B154Lysinibacillussp.

（属芽孢杆菌科）0.099%厚壁菌门D2B165Dokdonellasp.（属黄色单胞菌科）0.098%γ-变形菌纲表5健康香蕉园土壤16SrDNA文库部分克隆子测序分析健康香蕉园土壤16SrDNA文库的克隆子中有14个属，变形菌门占42%，厚壁菌门占26%，放线菌门占11%，酸杆菌门占6%，还有蓝藻门、硝化螺旋菌门等，图6基于16SrDNA序列的发病香蕉园土壤细菌系统发育树B图6基于16SrDNA序列的健康香蕉园土壤细菌系统发育树B香蕉地土壤真菌种类多样性图7

土壤总DNA的ITS扩增结果香蕉地土样总DNA的ITS序列扩增编号所属种属E值同源性D1I1Fusariumsp.(镰刀菌属)0.099%D1I2Stenellamusicola(疣丝孢属)0.095%D1I14Dioscoreapolystachya(薯蓣属)0.090%D1I16Cladosporiummusae(