阪崎肠杆菌检验

阪崎肠杆菌检验

GB4789.40-2010张秀丽河南省疾病预防控制中心第一页，共三十六页。Enterobactersakazakii(ES)2第二页，共三十六页。内容第一部分：一般特征第二部分：致病性第三部分：ES的检验3第三页，共三十六页。第一部分：一般特征培养特征生化反应抵抗力增殖能力与其他常见肠杆菌相似4第四页，共三十六页。一、培养特征

ES在VRBGA平板上首次划线分离时，37℃培养24h可生成2种不同的形态学特征：干燥或粘液状、圆锯齿状（凹口或锯齿），用金属环接触时可发现坚韧或有弹力，即粘贴金属环的菌量很少，并且菌落可很快恢复。传代培养后可能会转变为典型的光滑菌落。光滑、易于用金属环从菌落移取细胞。 ___国外文献报道5第五页，共三十六页。本实验室大多数分离株呈流蜡样，粉紫色、圆形、光滑、凸起、饱满，并散发出特殊气味；干燥、顶端发白的粉紫色菌落；从配方粉中初次分离到的该菌在VRBGA平板上过夜培养后呈现特殊的菌落形态：菌落干燥、边缘有褶皱，极富弹性。传代后，菌落皱褶减少，延长培养时间，可见皱褶逐渐增加。6第六页，共三十六页。二、生化反应

特征性生化反应结果D-山梨醇-产生吐温80脂酶+细胞外Dnase+氧化酶试验-黄色菌落+α-葡萄糖苷酶+7第七页，共三十六页。ES及亲缘关系较近的肠杆菌生化反应比较试验生化反应1阪崎肠杆菌阴沟肠杆菌产气肠杆菌成团肠杆菌日勾维肠杆菌赖氨酸脱羧酶－－＋－＋精氨酸双水解酶＋＋－－－鸟氨酸脱羧酶＋＋＋－＋KCN生长＋＋＋v＋发酵:蔗糖＋＋＋(＋)＋卫矛醇－(－)－(－)－核糖醇－(－)＋－－棉子糖＋＋＋v＋D-山梨醇－＋＋v－χ-甲基-葡萄糖甙＋(＋)－－－D-阿拉伯糖醇－(－)＋－＋黄色素＋－－(＋)－注：＋：90-100％；(＋)：75-89%；V：25-74％；(－)：10-24％；－：0-9％8第八页，共三十六页。三、抵抗力耐热性渗透压干燥不同菌株的耐热性存在明显的差别，但标准的巴氏消毒过程能有效的灭活ES。ES对渗透压的耐受性使该菌能够成为环境中的优势株，增加PIF加工后污染的危险性，使其在PIF中长期存活。9第九页，共三十六页。四、增殖能力6℃，21℃，37℃分别是13.7h，1.7h，19－21min。MRA发现，与本底相比，25℃放置6h该菌的相对危险性可增加30倍；25℃放置10h可增加30000倍。2004年2月FAO/WHO在日内瓦召开的PIF中ES专家研讨会上提出PIF中微量的ES（＜3CFU/100g）污染也能导致感染的发生。10第十页，共三十六页。第二部分：致病性易感人群主要感染渠道配方粉中ES的污染状况PIF中ES的来源及中毒发生的原因11第十一页，共三十六页。一、易感人群婴儿：脑膜炎坏死性小肠结肠炎菌血症严重的神经系统后遗症高危人群：主要是婴儿，新生儿、尤其是早产儿、低出生体重等免疫力低下的婴儿。死亡率：50%，20-50%成人：局部感染、菌血症、术后骨髓炎等12第十二页，共三十六页。二、主要感染渠道！！！乳品安全标准（报批稿）《婴儿配方食品》《特殊医学用途配方食品》0-6个月龄13第十三页，共三十六页。三、配方粉中ES的污染状况研究样品肠杆菌（+）ES（+）菌种（%）Muytjens等1980141（MPN/100g）75（51.8%）20（14.2%）E.agglomerans(24.8)E.cloacae(21.3)E.sakazakii(14.2)Iversen和Forsythe200482（25g）7（8.5%）2（2.4%）Pantoeaspp（2.4)E.cloacae(1.2)E.sakazakii(2.4)本试验室2006212（40g）103（48.58%）11（5.19%）Pantoeaspp（11.32）E.cloacae（7.55）E.sakazakii（5.19）产品召回食品、环境广泛分布14第十四页，共三十六页。四、PIF中ES的来源及中毒发生的原因目前公共卫生关注的PIF中ES的来源包括以下2种情况：内在污染——二次污染。

如：加工环境中微生物的存在；加工装置内表面微生物的存在；热处理后，与干燥基粉混合的加入成分中存在的微生物。外源性污染——配方粉调制环境和调制器皿。受ES污染的配方粉或调制配方在较高温度下存放，食用前不加热，或加热不彻底，喂食时间较长等都可导致ES有机会生长繁殖，增加患病的危险性。15第十五页，共三十六页。

PIF中ES的安全性问题，已成为全球关注的焦点。2002年ICMSF把ES列为“严重危害特殊人群，威胁生命、导致慢性实质性后遗症或长期影响”的一种病原菌。2004年2月FAO/WHO在日内瓦召开的PIF中ES专家研讨会：ES列为PIF中仅有的两种A类致病菌（沙门和阪崎）之一。16第十六页，共三十六页。第三部分

食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验第十七页，共三十六页。本标准修改采用ISO/TS22964（1stedition2006-02-01）Milkandmilkproducts—DetectionofEnterobactersakazakiiFDAJuly2002;RevisedAugust2002IsolationandEnumerationofEnterobactersakazakiifromDehydratedPowderedInfantFormula18第十八页，共三十六页。第一法：阪崎肠杆菌的检验

第二法：阪崎肠杆菌的计数

19第十九页，共三十六页。第一法

阪崎肠杆菌的检验20第二十页，共三十六页。阪崎肠杆菌检验程序报告生化鉴定挑取黄色菌落DFI琼脂36℃±1℃，24h±2h挑取蓝绿色菌落1mL+mLST-Vm10mL44℃±0.5℃，24h±2h检样100g/mL+稀释液900mL36℃±1℃，18h±2h前增菌选择性增菌选择性分离生化鉴定TSA25℃±1℃，48h±4h第二十一页，共三十六页。5.1前增菌和增菌BPW（合适时可选择无菌水）左图：未混合；右图：混合后。22第二十二页，共三十六页。mLST-VmmLST-Vm，即在大肠菌群增菌肉汤LST中另加入适量的NaCl和Vm。研究证明与其他肠杆菌科细菌（如沙门菌属、大肠埃希氏菌等）相比，ES具有较高的耐渗透压能力。加入0.5M的NaCl在保证ES良好生长的同时，可以有效地抑制上述其他细菌的生长。Vm可有效地抑制G+菌的生长。而较高的生长温度可以进一步抑制其他细菌的生长。23第二十三页，共三十六页。5.2分离显色培养基的基本原理相似，二者都是根据ES能产生α-葡萄糖苷酶，分解底物XaGlc产生有色菌落。24第二十四页，共三十六页。显色培养基对ES的选择性较好，ES形成的特征性菌落易于辨认，以DFI为例：硫化氢指示剂可以区分ES和产生少量α-葡萄糖苷酶但H2S阳性菌株（如普通变形杆菌）。ES都可以在该平板上生长并产生蓝绿色菌落其他常见菌在DFI平板的菌落颜色白色菌落：肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希氏菌、泛菌属的多种菌等黄色菌落：赫氏埃希氏菌黑褐色、粉色或中心蓝绿菌落：少量菌种ESIA:蓝色，1-3mm国产显色培养基25第二十五页，共三十六页。36℃±1℃24h±2h26第二十六页，共三十六页。黄色素TSA：25℃培养后典型ES：黄色阴性对照E.coliATCC25922：白色菌落27第二十七页，共三十六页。5.3鉴定（生化反应）生化试验特征黄色素产生＋氧化酶－L-赖氨酸脱羧酶－L-鸟氨酸脱羧酶（＋）L-精氨酸双水解酶＋柠檬酸水解(＋)发酵：D-山梨醇（－）L-鼠李糖＋D-蔗糖＋D-蜜二糖＋苦杏仁甙＋注：＋＞99%阳性；－＞99%阴性；（＋）90%－99%阳性；（－）90%-99%阴性。28第二十八页，共三十六页。商业生化鉴定系统的应用推荐使用的ES生化鉴定方法有很多，主要有API20E，ID32E，BiologGN2MicroPlate，VITEKGNI+等。上述方法都比较成熟，稳定性较好，已被许多国家和组织的标准采用。在肠杆菌的生化鉴定中使用最广泛的是API20E和VitekGNI+。29第二十九页，共三十六页。API20E生化鉴定板典型生化反应图示API20E反应编码API20E结果评价3345373Excellentidentification3305173Excellentidentification3305363Verygoodidentification3305373GoodidentificationAcceptableidentification？VITEK30第三十页，共三十六页。质量控制选择近期分离的阪崎肠杆菌阳性菌株或标准菌株作为阳性对照，检测增菌液和分离培养基对阪崎肠杆菌生长的影响和生化鉴定结果，对整个实验的操作过程进行质量控制。31第三十一页，共三十六页。阪崎肠杆菌检测方法的比较2005年从10个省（市）的零售或批发市场采集的194份配方粉。FDA定性检测检出4个阳性样本，本定性检测检出5个，其中4个在第一法的检测中均为阳性，另一阳性检出样品在第一法中的检测结果为阴性。*“粉紫色、圆形、光滑、凸起、饱满”。选择性分离平板上分离株的菌落特征和样品数量VRBGADFI菌落特征样品数量

菌落特征样品数量无任何菌落生长14无任何菌落生长163直径<1mm的菌落1371种蓝绿色菌落52种菌落61种白色菌落22典型菌落*5（3）白色菌落和蓝绿色菌落各1种31种非典型菌落32（1）1种白色菌落但略显淡绿1合计194

合计19432第三十二页，共三十六页。