转录组和蛋白组

利用转录组学和蛋白组学技术研究乳酸菌胁迫条件下自身应答机制郝彦玲副教授

食品科学与营养工程学院

2013年9月30日

食品微生物专题

转录组（transcriptome）：广义上指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合，包括信使RNA、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA；狭义上指所有mRNA的集合。1、转录组学测序技术介绍基因组（genome）：指的是细胞或生物体中所有的DNA，包括所有的基因和基因间隔区。

转录组具有时空特异性FromSangertoNextGenerationSequencing2、蛋白组学技术的介绍

蛋白质组(Proteome)：指由一个基因组或一个细胞、组织表达的所有蛋白质。蛋白质双向电泳技术(2D-Gel)

荧光差异凝胶电泳技术（2D-DIGE）

iTRAQ技术蛋白质双向电泳技术：是等电聚焦电泳和SDS的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后在垂直的方向再进行SDS（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。优点：双向电泳技术具有很好的分辨率和灵敏度，可以同时显示组织或细胞内各种蛋白，高分辨率确保蛋白质最大程度的分离。缺点：重复性是很不理想。高重复性有利于凝胶间的对比。

荧光差异凝胶电泳技术（2D-DIGE）采用专有的荧光染料与多重样本和图象分析的方法，在同一块胶上可同时分离多个由不同荧光标记的样品。

iTRAQ技术Whenchallengedwithbile,bacteriaareknowntomodifytheircellenvelopepropertiessuchascellmembranefattyacidcomposition,peptidoglycancompositionandmembranecharge.Exposuretobileisaseriouschallengetotheviabilityofprobioticsbecausetheconcentrationofbileacidsinthehumansmallintestinetypicallyvariesbetween0.2and2%Bilestresscanalsocausedeleteriouseffects,includingproteinmisfoldinganddenaturation,DNAdamage,secondarystructureformationinRNA,andintracellularacidification.14and22spotsweresignificantlyoverexpressedatthe0.6g/Land1.2g/Lbilesalts.Only4spotsweresignificantlydown-regulatedatthebothconcentrations.3spotswereonlydetectedonlywhenbilesaltswereaddedtothemedium.Oxbileextractpromotesinductionofgeneralstressresponseproteinsthematurationofnewlysynthesizedproteins,refoldinganddegradationofdenaturedproteinsandDNArepairs,suchasGroELandDnaK（2）Severalenzymesinvolvedincarbohydratecatabolism,includingthekeyenzymeoftheso-calledbifidobacterialshunt,areoverexpressedincellsgrowninthepresenceofbilesalts（4）Regulationbybilesaltsofproteinsinvolvedintranscription,translation,andmetabolismofaminoacidsandnucleotides.（3）生理指标的检测：Endmetabolicproducts（lactate,acetateandformate）andF6PPKweredetected.利用2-Dgel结合实时定量进行研究，创新点是推测出丙酮酸的代谢流向饱和脂肪酸，从而增强了膜的rigidityandimpermeability.转录组：基因芯片技术蛋白质组：2D-DIGE技术在0.2%的oxgal中培养，316基因，42个蛋白质发生显著变化。2011：

ResultsandDiscussion（1）GGAltercellsurfacepropertiesandexpressionmultipleABC-typemultidrugtransporterinresponsetobile.（2）Two-componentregulatorysystemsandbilesalthydrolasemodulatecellularresponsetobile（3）BileinducescommonstressresponseinGG.

（4）Bileaffectscentralmetabolicprocesses典型文章实验手段：DNA芯片和实时定量PCR。推测结果：通过转录组发现Genesencodingthreetransportsystemsbelongingtothemajorfacilitatorsuperfamily(MFS),Bbr_0838,Bbr_0832,andBbr_1756,andthreeABC-typetransporters,Bbr_0406-0407,Bbr_1804-1805,andBbr_1826-1827在胆盐胁迫下表达水平发生显著变化，推测可能参与胆盐胁迫。创新点：利用胆盐缺陷型的L.lactisNZ9000lmrCD作为宿主，通过异源表达证明其参与胆盐抗性。问题：酸奶对人体具有重要的益生保健功能，但是后酸化是制约酸奶行业发展的主要问题。原因：当pH值从6.5下降到5.5时，嗜热链球菌的生长逐渐减慢，pH值下降到5.0后，保加利亚乳杆菌控制了酸奶的发酵（郭清泉等，2001）。

立题的背景

后酸化：酸奶在正常发酵结束后的贮存、运输和销售过程中，发酵微生物的继续生长会导致产品pH值持续降低，进而发生后酸化现象（徐成勇等，2006）

乳酸菌酸耐受机制的研究进展质子泵F0F1-ATPase

（Arikadoetal.,1999）谷氨酸脱羧酶途径GAD

（Sandersetal.,1998）精氨酸脱氨酶途径ADI

（Curranetal.,1995;DeAngelisetal.,2002）应激蛋白和分子伴侣蛋白（Hartkeetal.,1996；

Coxetal.,2000）改变细胞膜的脂肪酸构成（CotterandHill,2003）（CotterandHill,2003）保加利亚乳杆菌的酸耐受机制的特殊性对保加利亚乳杆菌全基因组序列的分析表明,仅具有F0F1-ATPase基因簇缺失一些存在于其他乳酸菌中的pH调节相关的基因，如ADI途径中的arcA,B,C,T,D,R基因和GAD途径中的gadC,B基因（vandeGuchteetal.,2006）保加利亚乳杆菌的酸适应机制研究情况利用蛋白组学技术研究保加利亚乳杆菌经低pH诱导后的全蛋白表达情况如，

Limetal.,2000；

Fernandezetal.,2008；Streitetal.,2008利用反转录和实时定量PCR的方法，考察保加利亚乳杆菌中酸耐受相关基因的转录水平变化如，

Penaudetal.,2006中发现酸处理后铜离子转运蛋白CPX-TypeATPase的Ldb0660和Ldb1239基因大幅上调对于保加利亚乳杆菌感受环境压力并作出适应性调节这一过程的分子调控机制缺少系统性的研究2.研究目的及意义本课题拟采用蛋白组学、RT-qPCR、乳酸乳球菌表达系统、细菌单杂交和EMSA等分子生物学技术，对酸胁迫反应中的关键基因进行分离鉴定及功能研究。进一步揭示保加利亚乳杆菌酸耐受机制；为制备弱后酸化的保加利亚乳杆菌奠定基础；为开发具有自主知识产权的酸奶发酵剂提供理论依据。3.研究内容134蛋白组学方法分析保加利亚乳杆菌应对酸胁迫过程中的差异表达蛋白细菌单杂交和EMSA实验分析抗酸胁迫中新转录因子Ldb0667的功能2RT-qPCR分析差异基因转录水平的变化提出保加利亚乳杆菌酸耐受模型4.研究结果SurvivalofL.bulgaricusCAUH1afteracidadaptation.Acidadapted(40minattheindicatedpH)andcontrol(pH6.5)samplesweresubjectedtoanacidchallenge(60minatpH3.7).OD600

nm=

～0.4pH4.8,40min--700倍确定酸胁迫处理条件：致死处理条件：pH3.7,60min蛋白质双向电泳处理组对照组47pI47pIMW10904020MW10904020平均每块胶得到644个蛋白点，经ImageMaster2DPlatinumsoftware

分析，选取变化幅度大于1.5倍的蛋白点41个进行质谱鉴定Results

通过MALDI-TOF/TOF二级质谱鉴定了27个差异蛋白（17个上调，10个下调），利用NCBIBLAST、KEGG等数据库，确定其功能和参与的代谢途径糖类代谢:10proteins(GlcK,Eno,Pyk,GpmA,GpmB,Gap,Ack,Gpd,XfpandPgl)核苷酸代谢:3proteins(PyrG,CmkandPurR)翻译过程:7proteins(Tuf,FusA,TypA,Der,RplM,RpsSandRpsA)氨基酸代谢:2proteins(PepO1andPepN)胁迫反应:1

proteins(ClpC)未知功能:proteins(RnjA,Ldb0677andPthA)蛋白点质谱鉴定结果蛋白点质谱鉴定结果IDSpotno.ExpressionfactorA/NAGeneProteinAccessionno.2-DERT-qPCR糖酵解途径K144561.823.14glcKGlucokinase（葡萄糖激酶）YP_618316.1K226643.7229.86Ldb1036Fructose-2,6-bisphosphatase（果糖-2,6-二磷酸酶）YP_619006.1M15596-1.85-14.42gapGlyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase（3-磷酸甘油醛脱氢酶）YP_618713.1M236141.8313.45enoEnolase（烯醇化酶）YP_619161.1L111751.8610.78pykPyruvatekinase（丙酮酸激酶）YP_618880.1K45801.595.10gpmAPhosphoglyceratemutase（磷酸甘油酸变位酶）YP_618404.1L6304-1.61-22.32ackAcetatekinase（乙酸激酶）YP_618754.1戊糖磷酸途径M12180-1.51-6.68gpdGAPDH（磷酸葡萄糖脱氢酶）YP_619397.1M2110-1.53-24.76Ldb0534phosphoketolase（磷酸酮醇酶）YP_618635.1K103821.704.92Ldb0588putative3-carboxymuconatecyclaseYP_618678蛋白点质谱鉴定结果IDSpotno.ExpressionfactorA/NAGeneProteinAccessionno.2-DERT-qPCR伴侣蛋白L47-2.04-13.45clpCATP-bindingsubunitClpCgb|EGD26863.1|核苷酸代谢K375-1.48-20.25pyrGCtpsynthase（CTP合成酶）YP_004033330.1M175431.5123.43Ldb0774Cytidylatekinase（胞苷酸激酶）YP_812822.1L13554-1.62-21.86purRPuroperonrepressor（pur操纵子阻遏蛋白）YP_812402.1肽类降解M2641.6218.90pep01Endopeptidase（肽链内切酶）YP_618394.1M203271.509.97pepNAminopeptidaseN（氨肽酶N）YP_619704.1转录-翻译相关K247472.7323.75tufPutativeelongationfactorTuYP_618840.1M13561.885.66fusAElongationfactorGYP_618520.1N175131.47fusAElongationfactorGYP_618520.1K9142-1.74-13.55engAGTP-bindingproteinEngAYP_618891.1K113201.542.69typAGTP-bindingproteinTypAYP_618827.1

蛋白点质谱鉴定结果IDSpotno.ExpressionfactorA/NAGeneProteinAccessionno.2-DERT-qPCR核糖体蛋白M137941.762.18rplM50SribosomalproteinL13YP_812477.1K19533-1.52-10.93rpsA30Sribosomalprotei