现代基因工程-04将DNA引入活细胞

基因工程

第四讲：将DNA引入活细胞IntroductionofDNAintoLivingCells讲课提纲

概述4.1转化-使细菌细胞获取DNA4.2重组体的鉴定4.3将噬菌体DNA引入细菌细胞4.4重组噬菌体的鉴别4.5非细菌细胞的转化在创造出新的重组DNA分子后，接下来的步骤是将这些分子引入到活细胞中，通常情况下是细菌，并随着活细胞的生长和分裂产生出克隆。严格地讲，“克隆”这个词仅指后面过程，并不包括重组DNA分子构建本身。基因克隆的目的(1)目的(1)：

从有限数量的起始材料中产生出大量的重组DNA分子。用细菌中的质粒进行扩增，可以得到开始阶段的上千倍重组DNA分子。基因克隆的目的(2)纯化是克隆的第二个重要功能。重组DNA分子过程中，连接反应的混合物中可有其他的DNA分子：(1)未连接上的载体分子；(2)未连接上的DNA片段；(3)没有插入新DNA而重新闭合的载体分子(“自连接”载体)；(4)携带插入错误DNA片段的重组DNA分子。未连接的分子很少造成污染：

因为即便它们会被加入到细菌细胞中，也只有在非常例外的情况下才能发生复制。更多的情况下，宿主细胞中的酶会降解这些DNA碎片。自连接的载体分子和错误重组的质粒与目的分子以相同的效率被复制。通过克隆可以实现目的分子的纯化：对于任何一个细胞来说，携带超过一个DNA分子是非常罕见的。每个细胞都产生单一的克隆。不同的克隆包含有不同的分子：一些包含了目的重组DNA分子，一些包含自连接的载体分子。因此问题就转变成，如何鉴别出包含有正确重组质粒的克隆。4.1转化-使细菌细胞获取DNA绝大多数种类的细菌能够从它们生长的培养基中获取DNA分子。通常这种DNA分子都会被降解掉；偶尔DNA分子存活下来并复制；特别是带有复制起始点的质粒时，这种现象更有可能发生。判断质粒是否被获取和稳定地保持，通常是通过质粒所携带基因的表达情况来进行检测。例如，大肠杆菌细胞正常情况下对氨苄青霉素和四环素的生长抑制效应敏感，但是，包含有质粒pBR322的细胞，对这些抗生素有抵抗力。因为pBR322质粒含有两组基因：一个基因编码能够将氨苄青霉素修饰成对细菌无毒害作用的β-内酰胺酶；另一组编码使四环素无毒化的酶。4.1.1不同细菌获取DNA效率不同在自然条件下，转化很可能不是一个细胞获取遗传信息的主要方式。在实验室中只有很少种类能够很容易地被转化，它们都具有复杂的结合和获取DNA的机制。绝大多数细菌，仅能在正常条件下获取有限数量的DNA。为了高效地转化这些细菌，不得不让细菌经历一些物理和／或化学处理以增强它们获取DNA的能力。经历了这种处理的细菌细胞被称作感受态细胞。4.1.2大肠杆菌感受态细胞的制备人们发现，经过冷的盐溶液浸泡的大肠杆菌细胞，相比未经浸泡的细胞获取外源DNA要高效得多。习惯上使用50mM氯化钙溶液。

尚不非常清楚这一处理如何发挥作用的。可能原因：CaCl2使DNA在细胞外侧沉淀；盐溶液造成细胞壁的某种改变增强了对DNA的结合。当DNA加入到经过处理的细胞时，会吸附在细胞外表面并保持这一状态，这一步骤并不会发生DNA转化入细胞的反应(图5-3)。DNA真正进入感受态细胞，需要经过一次短暂的升高温度到42℃的刺激反应，但为什么这种热休克法能够有效促进细胞转化还不为人们所知。4.1.3对转化细胞的选择尽管进行了前述处理，转化效率仍然很低。必须找到一些方法，能够辨别出转化细胞。办法：使用携带有选择性标记的质粒。选择性标记：给转化细胞带来新的性质的基因，而这样的性质是未转化细胞所不具备的。例子：pBR322的氨苄青霉素抗性基因。转化实验后：只有吸收了质粒的大肠杆菌细胞才表现出ampRterR的性质，并在含有氨苄青霉素或四环素的琼脂培养基上形成菌落；未发生转化的细胞仍然是ampSterS，不能够在选择性培养基上生成菌落。因此，转化细胞和未转化细胞得到了区分。绝大多数质粒克隆载体，都至少携带一种赋予宿主细胞耐抗生素的基因，通过将这些宿主细胞铺到含有相关抗生素的琼脂培养基上来达到对转化细胞的筛选。需要记住的是，对抗生素的耐药性不能仅仅归因于转化细胞中质粒的存在。质粒中的抗药基因必须能够被表达，从而合成出把抗生素脱氧化的酶。抗药性基因的表达在转化后立刻开始进行，但是在细胞能够包含足够的消除抗生素毒性作用的酶之前，还需要几分钟的时间。所以，转化后的细菌不能在热休克处理后立刻铺到选择性培养基上，而是要首先加入一个小体积的不含抗生素的液体培养基中，并培育一段较短的时间，质粒复制和表达就能够开始进行。这样在细胞被铺到选择性培养基上，并遭遇到抗生素时，它们已经合成出了足够的耐药性酶，来保证自己能够存活于选择性培养基中。4.2重组体的鉴定如何区分携带重组DNA分子的菌落和含有自连接载体分子的菌落？因为绝大多数插入DNA片段的过程都不可避免地会破坏质粒分子中原本存在的某个基因的完整性（插入失活）。所以只要鉴别出该基因在转化细胞中已经失去活性，即不再表现出该基因的性质，就可以确定重组体的存在。4.2.1pBR322重组体的筛选-

抗生素抗性基因的插入失活在插入新的DNA片段前，pBR322有一些独一无二的限制性位点，可以打开载体分子，供DNA片段插入。如：仅有一个BamHI位点，位于编码耐四环素药性的基因内部。在BamHI位点插入DNA片段的重组pBR322分子，就不再能赋予其宿主细胞耐四环素的性质，这样该基因就被插入的外源基因破坏。含有重组pBR322分子的细胞依然能够对氨苄青霉素保持耐药性，但对四环素变得敏感(ampRterS)。方法：1.转化后细胞铺到含氨苄青霉素的培养基上培养到出现菌落。所有这些菌落都是转化细胞(未转化细胞是ampS，不能够在选择培养基上产生菌落)，但只有一小部分包含重组pBB322分子；绝大多数是正常的自连接质粒。2.为了鉴别出这些重组体，菌落被复制培养(replicaplated)到含有四环素琼脂培养基上。生长出来的菌落：携带有正常的pBR322质粒而没有插入DNA；没有生长的菌落含有重组体：ampRterS一旦知道了重组体的位置，可以从最初的氨苄青霉素琼脂平板上分离样品。4.2.2插入失活不仅仅针对抗生素抗性一些重要质粒载体使用的是不同的筛选系统。pUC8：携带有耐氨苄青霉素基因和lacZ'基因。

lacZ'基因编码β-半乳糖苷酶的一部分。利用pUC8作载体，利用的是lacZ'基因的插入失活，重组体不能合成β-半乳糖苷酶而被鉴别出来。β-半乳糖苷酶：是一系列将乳糖降解成为葡萄糖和半乳糖的酶中的一种。通常由lacZ'基因编码，该基因位于大肠杆菌染色体上。一些大肠杆菌菌株携带有经过修饰的lacZ'基因，该基因编码的蛋白相对于正常的lacZ'基因编码的β-半乳糖苷酶缺失了α-肽段的一部分。这些突变体只能够在其俘获一个携带有细菌基因组缺失的lacZ'基因的质粒时，比如说pUC8，才能够合成β-半乳糖苷酶。判断β-半乳糖苷酶是否存在：化学方法：乳糖被分解成葡萄糖和半乳糖；检测酶所催化的一个反应。X-gal是乳糖相似物，该物质能够被β-半乳糖苷酶降解并生成深蓝色的产物。如果X-gal(以及β-半乳糖苷酶的诱导物IPTG)和氨苄青霉素一起被加入到琼脂平板中：不含重组体的菌落，即能够产生β-半乳糖苷酶的细胞就将被标记成蓝色；含有重组体的菌落因为lacZ‘基因被破坏而无法合成β-半乳糖苷酶，将保持白色菌斑。这一系统被称作乳糖筛选(Lacselection)。4.3将噬菌体DNA引入细菌细胞将一个用噬菌体载体构建的重组DNA分子引入细菌细胞，有两种不同的方法：

转染；体外包装。4.3.1转染这一过程与转化是相同的，区别：使用的质粒载体换成了噬菌体。像质粒那样，将纯化的噬菌体DNA或重组噬菌体分子与感受态大肠杆菌细胞混合，并通过热休克将DNA引入到大肠杆菌细胞中。4.3.2体外包装λDNA分子与成熟的λ噬菌体颗粒相比，对培养中的细菌细胞的侵染，没有那么高效。因此，如果λ分子能够在试管中被包装到λ噬菌体的头尾结构中，将变得非常有用。包装需要一定数量的由λ基因组编码的蛋白质，这些蛋白可以从缺陷性λ噬菌体侵染的菌株中高浓度制得。所以，需要用到两个不同的体系。1.在单菌株体系中，缺陷性λ噬菌体在C0S位点有一个突变，因此内切酶不能识别C0S位点，不能切割λ连环体，造成缺陷性噬菌体无法完成复制。但它能够直接合成包装所需的全部蛋白。从细菌中收集蛋白并纯化，随后用于重组λDNA分子的体外包装。2.第二个体系中需要用到两个缺陷性λ噬菌体株。两个噬菌体株都在编码噬菌体蛋白外壳的某一组分基因带有一个突变位点：一个突变发生在D基因上；另一个突变发生在E基因上。由于突变基因造成的产物缺乏，导致完整的噬菌体衣壳结构无法形成，同时其他的噬菌体衣壳蛋白不断积累。所以，任何一个噬菌体株都无法完成在大肠杆菌中的侵染循环。如果使用两种细胞，一种被缺乏D基因的噬菌体侵染，另一种被缺乏E基因的噬菌体侵染，通过将两种细胞的裂解物混合在一起，就制得了体外包装的混合物。现在的混合物包含了所有必需的成分，能够将重组λ分子包装到成熟的噬菌体颗粒中。通过这两个体系，只需要把包装后的分子加入到细菌培养物中，就使得正常的λ侵染过程得以发生，进而可以把重组DNA分子引入到大肠杆菌细胞中。4.3.3噬菌体侵染的可视化形式噬菌体侵染循环的最后一个阶段是细胞溶解。如果加入噬菌体后，或在噬菌体DNA侵染发生后，被侵染细胞被立刻引入固体琼脂培养基，细胞溶解就能够以噬菌斑(plaque)的形象在菌苔上被观察到。每个噬菌斑都是一个噬菌体溶解细胞后留下的空白区域，能够发生转移并最终消化邻近的细胞。λ噬菌体和M13噬菌体都能够形成噬菌斑。λ噬菌体：真正的噬菌斑，因为细胞溶解；M13：噬菌斑稍有不同，因为M13无法溶解宿主细胞，导致被侵染细胞生长速度下降。这种下降足以在菌苔上产生一个相对空白的区域，和正常噬菌斑一样清晰可见。λ和M13载体的最终结果是得到一块存在着噬菌斑的琼脂平板。每个噬菌斑都是由单一的被转染或被侵染细胞形成，含有相同的噬菌体颗粒。这些噬菌体颗粒可能由自连接的载体分子或重组分子所组成。4.4重组噬菌体的鉴别4.4.1噬菌体载体的lacZ'基因插入失活所有M13克隆载体，以及部分λ克隆载体，携带有lacZ'基因的拷贝。正如质粒载体pUC8那样，在lacZ'基因内插入新的DNA会导致β-半乳糖苷酶合成失效。重组体能够通过将细菌细胞铺在X-gal琼脂培养基上鉴别出来：包含正常噬菌体的噬菌斑是蓝色；重组体噬菌斑是无色透明。4.4.2λcI基因的插入失活一些类型的λ克隆载体在cI基因上有独一无二的限制性位点(图2-9上图谱位置38)。cI基因的插入失活导致噬菌斑形态上的改变:正常的噬菌斑显得“混浊”；

cI基因被破坏的重组体形成的噬菌斑“清澈”。对于有经验的观察者来说，这种不同是相当明显的。4.4.3使用Spi表型的筛选在正常情况下，λ噬菌体不能够侵染那些已经整合了噬菌体P2的大肠杆菌细胞。因此λ被称作Spi(P2prophageinhibition)。一些λ克隆载体被设计成，外源DNA的插入会把载体从Spi+转变成Spi-，使得重组体能够侵染携带P2前噬菌体的细胞。在克隆实验中，携带P2前噬菌体的细胞作为这些载体的宿主；只有重组体是Spi-，因此也只有重组体才能够产生噬菌斑。4.4.4基于入基因组大小的筛选组装成熟噬菌体颗粒的包装体系，只能够将大小37到52kb的DNA分子插入到噬菌体头部结构中。任何小于37kb的DNA分子都不被包装。许多λ载体通过删除λ噬菌体DNA分子上大的部分而构建出来，因此长度小于37kb。这些载体只有在额外DNA插入，使整个基因组长度达到或超过37kb后，才能够被包装到成熟噬菌体颗粒中。因此，只有重组的噬菌体才能够进行复制。4.5非细菌细胞的转化如果酵母、真菌、动物和植物细胞被用作基因克隆的宿主，那么有必要开发出将DNA引入这些细胞的方法。尽管用氯化锂或醋酸锂处理会增强酵母细胞对DNA的吸收，并被频繁地使用在酿酒酵母的转化中，但通常来说，浸入盐水促进转化只对少数细菌有效。因而，对绝大多数更高等的生物来说，需要使用更加复杂的方法。4.5.1单个细胞的转化培养后的动物细胞，可以很容易的被转化，尤其当DNA在磷酸钙作用下在细胞表面沉淀时更是如此。对于其他类型的细胞，解