环境生物学第七章第三节

7.3细胞工程与环境污染生物治理7.3.1细胞工程概述细胞工程(CellEngineering)的定义

在细胞水平上（细胞增殖、分化、死亡）研究、开发和利用各类细胞的工程。细胞工程的发展主要建立在细胞融合（cellfusion）的基础上，人们可以根据需要，经过科学设计，在细胞水平上改造生物的遗传物质。它所要求的技术条件、实验设备及试剂、经费等均比基因工程要求的低一些。37℃40min促融剂人细胞小鼠细胞红色荧光染料标记的膜蛋白氯色荧光染料标记的膜蛋白融合细胞细胞工程的主要方法⊙细胞培养（cellculture）

将细胞从生物体内取出，然后在特制的培养容器内给予必要的生长条件，使其在体外（invitro）继续生长与繁殖。细胞培养有动物细胞培养、植物的花粉、原生质体的培养。幼龄动物剪碎组织胰蛋白酶处理细胞培养⊙细胞融合（cellfusion）

在一定的条件下，将两个或多个细胞融合为一个细胞的过程，细胞融合又称细胞杂交。基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体。细胞的融合过程，最初是细胞在促融因子作用下，出现凝集现象，细胞之间的质膜发生粘连，细胞质开始融合，然后在培养过程中，进而发生核融合，形成杂种细胞。⊙细胞重组

在体外条件下，运用试验技术从活细胞中分离出各种细胞的结构或组件，再根据需要把它们在不同的细胞之间重新进行装配，成为具有生物活性的细胞。重组有核移植和细胞器移植：①

核移植——

主要是借助显微操作仪，在显微镜下用微吸管把一个细胞中的细胞核吸出，直接移到另一个去核的细胞中。②

细胞器移植——

通过原生质体对已分离纯化的叶绿体的胞饮作用，进行叶绿体移植，或通过微注射、载体转移以及胞饮摄入进行线粒体移植。显微操作仪⊙遗传物质转移——基因在细胞水平的转移①

载体法——

利用双子叶植物如番茄、甜菜、棉花和大豆等常用载体转移基因的方法，将含有外源基因的根瘤农杆菌与受体原生质体共同培养，或将含有外源基因的质粒和受体原生质体用聚乙二醇（PEG）处理转化，最后由转化体培育成转化植物。②

直接导入法——

最常用的是微注射法，即在显微操作仪的帮助下，用微针直接对细胞进行注射，直接将外源基因注入到一个受体的受精卵的核内，然后合子便能发育成胚，并进一步发育成为成熟的个体。细胞工程的内容

包括微生物细胞工程、植物细胞工程和动物细胞工程，目前主要应用微生物细胞工程进行污染生物治理。⊙微生物细胞工程

微生物细胞工程应用微生物进行细胞水平的研究和生产，具体内容包括各种微生物细胞的培养（发酵工程）、遗传性状的改造（遗传学、发酵工程、基因工程）、微生物细胞的直接利用或获得细胞代谢产物等。其中微生物细胞原生质体融合技术是构建环境工程菌的基本技术。★微生物细胞原生质体融合技术——

首先经培养获得大量菌体细胞，用脱壁酶处理脱壁，制成原生质体。然后将两种不同菌株的原生质体混合在一起，使原生质体彼此接触、融合，再使融合的原生质体在合适的培养基平板上再生出细胞壁，并生长繁殖，形成菌落，最后测定参与融合的性状重组或产量变化情况，以筛选出重组子。微生物细胞原生质体融合的关键步骤：①原生质体制备→

原生质体（Protoplast）：细胞质壁分离后去掉细胞壁所余下那部分结构。原生质体具备原有细胞的全部内部结构与生理性能，但是它完全无细胞壁，失去了细胞的刚性而呈球形，对渗透压十分敏感。原生质体比较容易吸收外来的DNA、蛋白质等，同时，对外界理化因子比较敏感，在原生质体外面仅存原生质膜，在外界理化融合因子的诱导下，不同物种间的原生质体间的质膜相互融合杂交，并在适当的条件下，融合的原生质体再生出细胞壁并恢复原来完整的细胞形态与群落形态，构成具有多种遗传性状的新物种。

脱壁：为了进行细胞融合，必须先除去细胞壁。目前常用的方法是酶解法（主要采用溶菌酶、纤维素酶等）。②融合重组→

把两亲株的原生质体混合在一起，促进融合，然后将融合液涂布在平板上再生，检出重组子。融合重组示意图细胞壁溶菌酶细胞膜生长细胞原生质体培养融合的原生质体混合融合子原生质体原生质体融合细胞壁再生诱导原生质体融合的方法——化学诱导法：常用于细胞融合的化学促融剂是聚乙二醇（PEG），方法是：在得到两亲本原生质体后，等量混合两亲本的原生质体，加入适量的PEG和钙离子溶液，保温后，洗去多余的PEG，在选择培养基上筛选出融合子。——电融合法：借助电场的作用，引发细胞融合。③原生质体再生成细胞→

原生质体在等渗的培养基中重建细胞壁，恢复细胞完整形态，并能生长、分裂。④融合重组的测定→

通常采用染色体标记的遗传重组体来检测。7.3.2应用举例—利用原生质体融合构建环境工程菌芳香族化合物降解菌的构建PseudomonasalcaligenesCO可降解苯甲酸酯和3-氯苯甲酸酯，但不能利用甲苯和1,4-二氯苯甲酸酯PseudomonasputidaR5-3可以降解苯甲酸酯和甲苯，但不能利用3-氯苯甲酸酯和1,4-二氯苯甲酸酯融合子CB1-9可以同时降解上述4种化学污染物假单胞菌乙二醇降解菌：Pseudomonasmendocina3RE-15甲醇降解菌：Bacilluslentus

3RM-2苯甲酸和苯降解菌AcinetobactercalcoaceticusT3的原生质体融合菌株TEM-1可同时降解苯甲酸、苯、甲醇和乙二醇DNADNA融合纤维素降解菌的构建脱氢双香草醛（DDV）降解菌Fusobacteriumvarium对DDV的降解能力为3-10%脱氢双香草醛降解菌Enterococcusfaecium对DDV的降解能力为3-10%融合细胞FE7菌株DDV降解率高达80%融合聚乙二醇（PEG）诱导原生质体融合制备细菌杀虫剂玉米螟球形芽孢杆菌BacillussphaericusTS-1：杀：淡色库蚊（双翅目）苏云金芽孢杆菌Bacillus