环境生物学课件遗传工程原理与应用

1.生物降解的局限性(1）没有一种微生物可以降解所有的有机污染物(2）污染物包含各种化学物质，一种微生物也许只能降解混合物的一种成分，而且可能受到别的成分抑制(3)在某些恶劣条件下，微生物难以有效降解污染物(4）许多非极性的化合物可能会吸附在土壤和沉淀物上,使生物难以降解(5）有些高浓度有机化合物可以抑制微生物的降解活性或生长第八章：遗传工程原理及其在生物降解中的应用基因操作是解决上述问题的可能途径！！2.DNA重组技术原理重组DNA技术，是达成基因信息（DNA）在生物体之间转移的一系列实验流程的简称(图1）。多种方法可以达到基因转移的目的。重组DNA实验通常遵循以下程序:1.供体DNA经抽提、酶切、连接到另一个DNA载体（质粒）上，形成一种新的重组DNA分子2.构建体转入宿主细胞。将DNA导入一个宿主细胞的过程称为转化3.经过鉴定选出含有DNA构建体的宿主细胞（称为转化子）4.构建体在宿主细胞中表达所需的蛋白质

图2.可同时降解樟脑、辛烷、二甲苯、萘的菌株的构建含有降解樟脑质粒的菌株A，与含有降解辛烷质粒的菌株B接合，质粒转移并发生同源重组，产生一个带有降解樟脑和辛烷的融合质粒的菌株E。含有降解二甲苯质粒的菌株C，与含有降解萘质粒的菌株D接合，产生一个带有降解二甲苯质粒和降解萘质粒的菌株F。菌株E和F接合产生一个菌株G，它携带有一个降解樟脑和辛烷的融合质粒，一个降解二甲苯质粒和一个降解萘质粒。3.质粒转移（1）混合污染物的降解（2）低温环境中的生物降解

大多数通过质粒转移进行基因操作的具有降解性能的细菌是嗜温细菌，这些微生物只有在20℃～40℃才可以良好生长。但是被污染的河流、湖泊、海洋通常只有0～20℃。

一种从嗜温性菌株恶臭假单孢菌(Pseudomonasputida)中的ToL(降解甲苯)质粒通过接合作用转入一种耐寒的，并可在0℃时降解水杨酸的恶臭假单胞菌种。转化后该菌可同时在低温下降解水杨酸和甲苯。

转化株携带有转入的TOL质粒和它自身的SAL质粒（降解水杨酸），可以在0℃时利用水杨酸或者甲苯作为唯一的碳源(表1)，而野生型(未转化)的耐寒恶臭假单孢菌在以甲苯作为唯一碳源的条件下，任何温度都不能生长

表1.不同温度下以水杨酸或甲苯为唯一碳源时野生型（非转化）和转化的耐寒恶臭假单孢菌P.putida的传代时间

温度（℃）传代时间野生型+水杨酸转化子+水杨酸转化子+甲苯37没有生长没有生长没有生长302.22.52.0252.13.21.3202.63.81.9153.24.22.9106.35.63.3513.912.912.2018.618.124.4（3）放射环境中的有机污染物降解射线对大多数微生物细胞都具有杀灭作用,因此在放射环境中处理有机物染物的细菌必须具有抗射线的能力.非致病土壤细菌耐辐射球菌Deinococcusradiodurans对高水平的放射有天然抵抗作用。这种抵抗作用归功于其对DNA的修复能力，它对于DNA损伤的修复非常有效。而且，任何导入该耐辐射球菌的外源DNA，不管是以质粒的形式还是插入到染色体上，都能抵抗高剂量的辐射。由于这种细菌能在持续放射性污染物的有毒环境中表达生物清除蛋白,因此是理想的候选细菌。图3显示了Deinococcusradiodurans对放射线的抵抗能力。

图3.γ射线对大肠杆菌和耐辐射球菌的影响4.降解酶在细胞表面的表达细菌表达的降解酶一般都是在胞内的,而细胞对某些目标底物(特别是一些非极性物质)的摄入速率是很慢，因而降解速率也相对较慢，而利用纯化的酶来催化底物降解与去毒化作用，成本则过于昂贵。因而，人们建立了一种新的方法来解决这一问题。通过对大肠杆菌的工程化处理，使有机磷水解酶在细菌外表面表达，成为含大肠杆菌脂蛋白信号肽和脂蛋白N端部分以及外膜的蛋白A的融合蛋白的一部分(图6,7)。这样，就可以解决细菌摄取杀虫剂速率过慢的问题。定位于细胞膜表面的有机磷水解酶的细菌降解活性是胞内表达相同量的7倍，而且酶活性相当稳定。37℃下100%活性可以保持1个月。

图5.定位于细胞膜表面的有机磷水解酶示意图该酶暴露于环境中并具有有机磷水解酶活性。Lpp包括大肠杆菌脂蛋白N端前9个氨基酸。OmpA包括外膜蛋白A的跨膜区（氨基酸46-159）。OPD包括产黄菌属FlavobacteriumSPP.的有机磷水解酶基因及其信号肽。图4.产生融合蛋白Lpp-OmpA-OPD的DNA构建体构建体含有大肠杆菌lac启动子，大肠杆菌脂蛋白信号肽lpp和脂蛋白N端前9个氨基酸，外膜蛋白A的跨膜区，以及产黄菌属FlavobacteriumSPP.的有机磷水解酶基因及其信号肽。5.抗有机溶剂萃取效应的微生物当废水中有机溶剂含量较高时会对微生物细胞造成伤害，影响其降解能力。因为细胞膜的主要成分是磷脂、脂蛋白和脂多糖等，而有机溶剂可以不同程度地溶解这些物质，从而破坏细胞膜，使细胞失去活性。因此处理含有机溶剂废水的微生物必须是对有机溶剂具有抗性的微生物菌种。人们早就注意到一个现象，即发酵法生产有机溶剂（如丙酮，醋酸丁脂等）的菌种对有机溶剂具有天然的抵抗力。但人们早期并不知道其所以然。近来，随着分子生物学技术的发展，已阐明了其分子机理。

能抵抗有机溶剂萃取作用的微生物有一种酶，它可以将细胞膜中的顺式脂肪酸转变成反式脂肪酸。反式脂肪酸组成的脂类物质具有非常稳定的空间构相，不易被有机溶剂破坏，但脂肪酸的生物化学性质仍然存在，所以这种微生物在含有有机溶剂的环境中细胞膜还能保持完整的结构。这就保证了细胞在抵抗有机溶剂的同时还具有细胞的一切生物活性。这种酶一般是组成型的，即在细胞质中一直存在，但平