食品毒理学基础

食品毒理学基础外推

毒理学实验的基本原则在实验动物中产生的作用，可以外推与人实验动物必须暴露于高剂量成年的健康的（雄性和雌性未孕）实验动物与人的暴露途径相同1.外来化学物在实验动物产生的作用，可以外推于人基本假设为：①人是最敏感的动物物种；②人和实验动物的生物学过程包括化学物的代谢，与体重（或体表面积）相关。2.实验动物必须暴露于高剂量(1)毒性试验的设计并不是为了证明化学品的安全性，而是为了表征化学品可能产生的毒作用。(2)毒理学试验中实验模型所需的动物总是远少于处于危险中的人群。3.成年的健康实验动物成年的健康（雄性和雌性未孕）实验动物作为一般人群的代表性实验模型。幼年和老年动物、妊娠的雌性动物、疾病状态作为特殊情况另作研究。4.与人的暴露途径相同毒理学试验中染毒途径的选择，应尽可能模拟人接触该受试物的方式。毒理学试验的局限性实验动物和人的敏感性不同主观感觉无法表述剂量设置过大动物数量有限毒理学试验的基本目的受试物毒作用的表现和性质剂量-反应研究确定毒作用的靶器官确定损害的可逆性1.受试物毒作用的表现和性质在急性和慢性毒性试验中，观察受试物对机体的有害作用，对有害作用的观察应该是对每个实验动物进行全面的、逐项的观察和记录。发现有害作用是进行剂量-反应(效应)研究的前提。Log[Dose]BiologicalResponseNOEL:NoObservableEffectLevelNOAEL:NoObservableAdverseEffectLevelLOEL:LowestObservableEffectLevelLOAEL:LowestObservableAdverseEffectLevelFEL:FrankEffectLevel2.剂量-反应(效应)研究

动物实验的职业道德给予人道主义的管理和处理使痛觉和不适减少到最低程度避免不必要的使用实验动物3R原则替代（replacement)：应用无知觉材料代替使用活的有知觉脊椎动物减少（reduction)：在能保证获取一定数量与精确度的数据信息的前提下，减少动物的使用数量。优化（refinement)：在必须使用动物时，要尽量减少非人道程序的影响范围和程度。实验动物物种的选择在代谢、生物化学和毒理学特征与人最接近的物种易于饲养和试验操作的物种自然寿命不太长的物种经济并易于获得的物种经验性实验动物选择两个物种：啮齿类、非啮齿类最常用的啮齿类是大鼠和小鼠；非啮齿类为犬豚鼠常用于皮肤刺激试验和致敏试验兔用于皮肤刺激试验和眼部刺激试验遗传毒理学用小鼠；致癌用大鼠致畸用大鼠、小鼠、兔迟发神经毒性常用母鸡常用实验动物生理学参数参数猴犬猫兔大鼠小鼠成体体重3.5143.33.70.450.035寿命(year)161514631.5断乳体重4.45.830.1-1.50.0450.012妊娠期1686363312120生殖年龄54910632实验动物品系的选择品系（strain):用计划交配的方法，获得起源于共同祖先的一群动物。遗传学分类：近交系、杂交群、封闭群、近交系、突变系动物、转基因动物近交系动物（Inbredstrainanimals）又叫纯系动物。是采用同胞兄妹或亲子交配，连续繁殖20代以上所培育出来的遗传上达到高度一致的动物群。

基因纯合程度可达99.8%。①

主要指啮齿动物；可出现近亲交配衰退。②

亲子交配与兄妹交配不能混用。③

亲子交配时必须采用年轻的双亲同其子女交配。④

较大动物纯种培育很难获得成功，因为世代间隔较长，费用较大，所以成功率低。⑤

禽类和兔的血缘关系达到80%以上（相当于兄妹交配四代）时，即可称为近交系。1基因位点纯合性在人工控制下有系统地进行近亲交配，使杂合型祖代基因逐代地基因分离，从而逐渐提高个体与群体的基因纯合率，在通过连续20代兄妹交配的培育之后．近交系动物任何一个基因位点上的纯合概率高达98．6％以上，品系内各个体在遗传上同属一种基因类型，因而能繁殖出完全一致的纯合子后代，并且动物群中不再携带未知的隐性基因，品系保留和表现所有的遗传性状，个体相互支配繁殖不会出现性状分离。2遗传组成的独特性在一个近交品系内，所有动物个体都可追溯到其原始的一对共同祖先。但它们只是从祖先的整个基因库里获得极少部分基因，这些基因的组合构成了品系的遗传组成。近交品系内的所有个体在遗传上完全相同，具有独特的表型特征，而不同的近交系之间的差异又非常明显，由于近交系的遗传同源性，若对近交品系中的某一个体进行基因分析可得知整个品系的基因类型。3．长期遗传稳定性近交品系由于遗传组成的高度纯合性和同源性．使其具有长期遗传的稳定性。4．均一性近交品系内个体间在表型上具有均一性．这是遗传同源性的结果，尤其是那些由遗传决定的生物学特征。杂交群动物及其特点杂交群动物：指两个不同的近交系之间有目的进行交配，所产生的第一代动物。例如：C57BL/6J×DBA/2→B6D2F1B6为C57BL/6J的缩写，D2为DBA/2的缩写。1具有杂交优势杂种一代动物具行较强的生命力，对疾病的抵抗力强，寿命长，容易饲养，在很大程度亡克服了因近交繁殖引起的近交衰退现象，适合于进行各种长期慢性实验。2遗传和表现型上的均质性杂交群动物与一般的F1代动物不同，它虽然为杂合体，但具有与近交系相似的个体均质性，具有较高的一致性，不容易受环境因素变化的影响。3．具有杂合的遗传组成F1代动物是杂合体．同时具有两个亲本品系的基因，个体之间的基因型又是同一的，因其具有两个亲本的特点，可接受两个亲本品系的细胞、组织、器官和肿瘤移植，适用于免疫学和发育生物学等领域的研究。封闭群动物及其特点封闭群：一个种群在5年以上不从外部引进新血缘，仅由同一品系的动物在固定场所随机交配繁殖的动物群。封闭群又称远交群。封闭群动物的杂合性，避免了近交衰退的出现，因此具有较强的繁殖力和生活力；封闭群动物的遗传组成具有很高的杂合性；封闭群动物常因基因突变而导致动物某些方面异常突变系概念及其特点突变系是指正常染色体的基因发生了突变，从而具有某种特殊性状表型的各种遗传缺陷的品系。突变系动物有助于认识生命的复杂性；突变系动物可以作为人类疾病的动物模型在基础医学和临床医学中应用。裸鼠转基因动物转基因动物是指以实验方法导入的外源基因在动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。实验动物按微生物分类按微生物学控制标推或微生物净化程度，目前国际上一般将实验动物分为四个等级，即无菌动物、悉生动物、无特定病原体动物和普通动物。无菌动物在自然界中并不存在，是在隔离器中经人工取得仔体，用无菌母体代乳或人工哺乳，经净化培育得到。无特定病原体动物饲育在屏障或隔离系统中，通过无菌动物、悉生动物、无特定病原菌动物获得的。笼具、饲料饮水要经过特殊处理，并有严格的检疫、消毒隔离制度。悉生动物又称清洁动物，种系清楚，没有该动物特有的病原菌。饲养在屏障系统中，空气要经过净化、饲养室套保持正压，进入室内的一切物品要经过消毒灭菌，工作人员进入要洗澡和穿灭菌工作服，动物饮灭菌水。普通动物是在微生物控制上要求最低的动物，饲养在开放系统，空气未净化，可饮自来水，房舍要求有通风设施，人员进入要穿工作服专用鞋帽。实验动物设施的分类开放系统：饲育环境与外界相同；有强力通风设施、饲料饮水和垫料要求不被污染，应防鼠和防昆虫措施。屏蔽系统：洁净度万级，环境封闭，送入的空气要过滤。饲料饮水和垫料要灭菌，饲养人员要经过淋浴、穿无菌工作服，戴口罩手套。隔离系统：洁净度百级，以隔离器为主体，送入的全新风达百级以上，一切物品经严格灭菌，饲养人员不得入内。【上海斯莱克实验动物有限责任公司】【中国科学院上海实验动物中心】【国家啮齿类实验动物种子中心上海分中心】实验动物个体的选择性别：一般雌雄各半，特殊？年龄和体重：急性毒性用成年，慢性用年幼或初断乳的实验动物。生理状态：避免妊娠反应，特殊？健康情况：将康在实验前观察5-7天实验动物的管理动物的管理：接收、饲养、来源、鉴别等记录环境条件控制：温度、湿度、通风、光照、噪音、垫料等设施管理：清洁卫生、废弃物管理等实验动物的准备实验动物前的准备：观察、性别辨认实验动物的抓取和固定实验动物的编号实验动物随机分组实验样品的制备了解样品的纯度和杂质化学结构和理化性质挥发性、溶解性、酸碱度、稳定性所需样品总量的计算总量=（A×B×C×D)×1.2A：每组动物数；B：各处理组的计量和C：染毒次数：

D：动物的平均体重溶剂和助溶剂的要求无毒或实际无毒与样品不起反应不影响样品的毒效无特殊刺激性气味遗传毒理学用小鼠；致癌用大鼠致畸用大鼠、小鼠、兔迟发神经毒性常用母鸡制备样品制剂时的要点加热样品时不应接近改变样品化学性质或物理性质的温度如样品为固体评价其对皮肤的毒性时，应保持其形状和颗粒大小多成分的样品应按配方配制如可能，制剂pH应为5-9不应用酸或碱使样品解离如应用非胃肠道途径，终溶液尽可能接近等渗染毒途径静脉注射、吸入、肌内注射、腹腔注射、皮下注射、口服、皮内注射、经皮经口染毒特点喂饲：动物自行摄入，一般最高含量<5%，营养成分可更高，不适宜于口感差，易挥发水解的样品，实际染毒量计算需单笼饲养。灌胃：操作前禁食空腹，大鼠隔夜，小鼠4个小时，均不停饮水，灌胃后2-4小时提供饲料，经口多次染毒一般不禁食。吞咽胶囊：适用于易挥发水解和有异味的样品。操作要点喂饲：动物自行摄入，一般<5%,一些有营养价值的事物成分可更高，但应注意不要造成营养成分失衡而影响动物的生长发育。不适于口感性差的样品；易挥发或水解的样品；若要计算实际染毒量需单笼饲养。灌喂：灌喂前应禁食空腹，大鼠隔夜禁食，小鼠可禁食4小时，均不停饮水，灌喂2-3小时后提供饲料。若经口多次染毒经呼吸道染毒静式吸入染毒：染毒时间一般为两小时，要求样品在10分钟内挥发完毕。动式吸入染毒：每天的染毒时间为6小时，保证氧气的浓度为19%。气管内注入：建立急性中毒模型。注射染毒皮下注射：注射时以左手拇指和食指提起皮肤将注射器刺入皮下，注射部位一般为大腿外侧小腹部、背部或耳根部。皮内注射：需局部脱去背毛，消毒后用左手拇指和食指按住皮肤并使之绷紧在两指之间紧贴皮肤表层刺入皮内。肌内注射：选肌肉发达无大血管通过的部位一般为臀部，注射时垂直迅速刺入肌肉。腹腔注射：注射时左手抓住动物，腹部向上右手于左下腹部刺入皮下。静脉注射：一般采用尾静脉还有耳部，犬可采用头静脉。染毒途径与染毒量经口20ml/kg（对空腹动物）；经皮2ml/kg；静脉1ml/kg；肌内注射0.5ml/kg（每一部位）；每眼0.01ml/kg；吸入2mg/L;鼻孔0.1ml生物标本采集血液采集尿液采集胆汁采集粪便采集血液采集终末取血：以动物死亡为实验结束非终末取血：麻醉或清醒的实验动物身上单次或多次采血。血液总量取决于物种、性别、年龄、健康及营养状况，一般总循环血量为55-77ml/kg体重。单次取血量低于动物总血量的15%，取血量在15~20%血压降低30%，30~40%引起缺血性休克，40%时引起50%实验动物死亡。单次采血不超过动物总血量的15%，可在3~4周后重复采血。多次采血每24h不应超过总血量的1%，取血量不超过0.1ml时，可通过尾尖取血，也可以通过眼眶取血。不赞成在无麻醉条件下取血。尿液粪便采集可用代谢笼下部有粪尿分离器，取粪便分析时剔去表层，取内层分析。麻醉麻醉分为四个时期：痛觉丧失期、兴奋期、耐受期、窒息期。痛觉丧失期：从药效开始发挥到意识丧失兴奋期：从意识丧失开始出现到规则呼吸结束，呼吸不规则，瞳孔扩大，运动反射增强，眼球震颤耐受期：从规则呼吸开始到自主呼吸结束，分为四段（1）规则呼吸，瞳孔缩小（2）骨骼肌松弛，瞳孔缩小，呼吸平稳，痛觉缺失，是进行手术的最佳时期（3）只有角膜反射，呼吸困难，瞳孔扩大（4）呼吸平稳，瞳孔扩大窒息期：没有反射没有呼吸，濒临死亡，需立即用解毒剂防止死亡意识丧失，痛觉丧失，肌肉松弛是手术的最佳时期，将麻药分为长效（长于120min）、中效（120min）、短效（30min）。麻醉时和麻醉后必须检查动物的体温，体温降低时需使用加热灯、加热垫麻醉终止后动物要经历和麻醉过程相同但顺序相反的几个时期。常用的麻醉药物短效：对啮齿类多用乙醚，大动物用硫喷妥钠10~25mg/kg静脉或腹腔注射中效：推荐用赛拉嗪+氯胺酮肌内注射长效：常用戊巴比妥钠静脉或腹腔注射安死术具有保证动物中枢神经系统立即达到失去痛觉的早期抑制作用，应是无痛苦、不引起兴奋，能快速导致一时丧失和死亡。推荐的安乐死方法小鼠：断头、脱颈伴放血、80%的二氧化碳、适宜挥发性麻醉剂、戊巴比妥钠伴放血。大鼠：撞击，脱颈、断头、80%的二氧化碳、适宜挥发性麻醉剂、戊巴比妥钠伴放血。兔子：猛击，并用脑定位打击、撞击伴放血、戊巴比妥钠伴放血1.对照原则在动物实验中，要求相比较的各组间动物的种类、性别、年龄、体重等尽可能地一致。对照组与实验组同等重要，两组的动物数应相等。(1)空白对照：又称正常对照(2)标准对照：又称有效对照或阳性对照(3)组间对照：(4)自身对照：科研设计遵循的三原则2.重复原则(1)足够的实验样本数：

(2)实验结果的可重复性：3.随机原则

为了减少个体差异这种非处理因素的干拢，应于实验前将实验动物依统计学原则进行随机分组，以此达到尽可能降低非处理因素的混杂效应，从而提高每组动物间均衡性的目的。随机分组方法：①随机数字表法；②计算机软件（如SPSS、SAS、Excel等）三、毒理学动物实验设计内容1.实验动物选择：2.实验动物分组与剂量选择、实验期限：Log[Dose]BiologicalResponse低剂量组：NOAEL中剂量组：LOAEL高剂量组3.实验观察指标选择：实验指标（观测指标）是指在实验观察中用于反映研究对象中某些可被检测仪器或研究者感知的特征或现象标志。特异性客观性

灵敏度

精确度可行性

认可性

实验指标选择的基本条件

实验指标选择依据根据实验的目的、任务和内容选择指标。根据化学物的种类和用途来选择国家标准、部委和各级政府发布的法规、规定和行业规范中相应的程序中的实验方法要求来选择指标。4.统计学处理方法数据类别和统计学要求统计学方法1．“有或无”数据：动物间的比较个别组的比较Fisher精确分布检验(不分层的数据)2×2校正的卡方检验(分层或不分层的数据)非均匀性2×K卡方检验(分层或不分层的数据)与剂量相关的趋势Armitage检验(分层或不分层的数据)动物内部比较个别组的比较McWemar检验或符号检验非均匀性Cochran检验变量问的相关性Fisher精确分布检验2X2校正的卡方检验2．分级数据：动物间的比较个别组的比较MannWhitneyu检验非均匀性Kruskal—Wallis单向方差检验与剂量相关的趋势非参数趋势检验动物内部的比较个别组的比较Wilcoxon配对符号秩和检验