pcr与hrm比较在小鼠基因型

高分辨率溶解曲线和pcr在小鼠基因鉴定中的的对比摘要

目前，在基因型鉴定方面大部分都是通过普通pcr，但是pcr需要通过跑胶、测序，耗费了大量的时间与精力。本次试验对象是OB和DB型老鼠，OB和DB型老鼠基因序列重复结构比较多，同时又是点突变，引物设计比较困难。在此基础我们运用了hrm技术，首先hrm技术在操作上简单易学，不需要特异性探针，成本比较低，而且hrm的根据样品中DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性的差异，其极高的温度均一性使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。综述ob型小鼠是由于在碱基序列的第105位发生点突变由C→T,导致该位点上的氨基酸的改变由精氨酸CGA转变为终止密码子TGA。这种突变使ob基因表达产物活性丧失,所以表现为肥胖。db小鼠是小鼠由于编码瘦素Leptin受体的糖尿病基因胞内区外显子内发生G→T点突变导致的先天肥胖性2型糖尿病型小鼠，其小鼠表现出多食、肥胖及血压升高并且受体结合力也较低。

HRM

基本原理就是利用与DNA双链与荧光染料相结合，在温度逐渐升高的过程中DNA会发生减色效应，通过检测双链DNA在熔解过程中所释放的染料荧光信号所形成的特征熔解曲线，从而对基因序列中的核苷酸差异进行鉴别。实验步骤一、db/ob小鼠DNA提取二、进行基因型的鉴定1、普通pcr2、hrm技术

1、剪尾：剪1cm左右的尾巴，或者小鼠耳朵2、处理材料：1）动物组织应先打碎处理为细胞悬浮液，然后10,000rpm离心一分钟，倒尽上清，加200ul缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。2）加入20ulproteinasek溶解，混匀。56℃放置，直至组织溶解，简短离心除管壁内水珠，隔夜消化一天一、DNA提取3）、加入200ul缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁水珠。4）、加入200ul无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。5)、将上步所得溶液和絮状沉淀都加入一个96孔吸附板CB3中，加盖新的封口膜3,600rpm离心10min，倒掉深孔板中的废液，将吸附板重新放在深孔板上。6）、像96孔吸附板CB3中加入500ul缓冲液GD加盖新的封口膜3,600rpm离心10min，倒掉深孔板中的废液，将吸附板重新放在深孔板上。7）、像96孔吸附板CB3中加入500ul缓冲液PW加盖新的封口膜3,600rpm离心10min，倒掉深孔板中的废液，将吸附板重新放在深孔板上。8)、像96孔吸附板CB3中加入600ul漂洗液PW加盖新的封口膜3,600rpm离心10min，倒掉深孔板中的废液，将吸附板重新放在深孔板上。9）、3600rpm离心10min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。10）、将96孔吸附板CB3转入一个新的96孔深孔板中，像吸附膜的中间部位悬空滴加80ul洗脱液TB，室温放置5-10min，加盖新的封口膜3,600rpm离心10min收集DNA。常规pcr体系二、鉴定常规pcr程序温度（℃）时间（min）循环数（cycles）9595657295557272105min30S30S30S30S30S30S5min-----1120202020201HRM体系hrm程序温度（℃）时间循环数（cycles）95956572954065975min10s15s20s60s60s1s1果分析DB型小鼠红色表示mut/mut纯合子，橙色表示wt/wt表示野生，蓝色表示mut/wt表示杂合OB型小鼠注：

红色表示mut/mut纯合子，橙色表示wt/wt表示野生，蓝色表示mut/wt表示杂合子结论从实验的两组小鼠中可以看出，普通pcr程序后，跑胶后的图模糊不清，并且其特异性也比较差，这是由于于OB&DB小鼠都属于点突变，并且OB&DB碱基序列中重复度比较