mofloXDP流式细胞仪基本原理以及应用

流式细胞仪基本原理以及应用

张宇eckmanCoulter细胞研究必备的仪器细胞成像、定位（单个细胞）细胞定量测定（群体细胞特征）分析型：一个细胞的身世：我是谁混杂的细胞群激光激发标记在细胞上的荧光素Directlytowaste仪器的电子系统收集荧光信号并处理信号计算机工作站对信号进行收集和统计流式细胞仪是通过对目标细胞上的荧光信号进行识别

而实现对细胞的定量一个细胞的命运混杂的细胞群身份的鉴定识别和通过的速度分选是一个复杂的过程流式细胞仪是细胞组学的定量工具可以做以下定量：细胞相对定量（％）细胞绝对定量（细胞/µl）细胞膜蛋白表达定量（蛋白分子/细胞）流式细胞仪的检测范围细胞结构细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体流式细胞仪基本原理通过激光激发高速流动的细胞或微粒所携带的荧光染料或荧光素，并检测由此产生各种光信号，如散射光、自发荧光、特异性荧光的强弱，来反映各项待检测指标。成功的流式实验需要三步走：下游实验,培养或者其他生物手段验证流式样本制备单细胞悬液制备样本保存荧光标记设置对照单细胞悬液制备样本浓度要求：建议105~106/ml血样本样本要求：EDTA、肝素、柠檬酸钠抗凝全血凝血、溶血样本应当弃用

白细胞样本：需裂解去除红细胞

裂解液的选择：甲酸作用强，适用于一般检测

氯化铵作用温和，适用于低含量细胞

注意：温度过低会影响裂解效果

红细胞样本：PBS或生理盐水稀释1000倍

血小板样本：避免使用肝素抗凝血，PBS或生理盐水稀释20倍

培养细胞一般处理：消化分散成单细胞，过300目滤网去除细胞团块易聚集的细胞：可在缓冲液中加1~3%的小牛血清或BSA或0.05%EDTA

单细胞悬液制备组织细胞脾细胞，在缓冲液中将血洗净，剪成数块，直接在300目滤网上研碎过筛肝、肾组织及结肠癌等富含实质细胞的组织，于缓冲液中充分剪碎，细胞分散于缓冲液中，过100目滤网，再过300目滤网

肺、肠粘膜等结缔组织较多的组织，剪碎并用胰酶、胶原酶等消化分散骨、软骨、心肌、骨骼肌、脑组织等，可尝试机械剪碎及酶消化后于培养液中静置贴壁分离细胞，但可用的细胞往往较少，最好进行原代培养

单细胞悬液制备外周血样本：在不处理的情况下于4度存放3~5天，仍可用于大多数表面分子标记检测。但做细胞绝对计数应在24h内检测固定：低浓度的甲醛或多聚甲醛固定（<1%）可用于培养细胞或已分散成单细胞的组织来源样本的短期保存（<1周）

过高浓度的甲醛会影响抗原抗体结合及导致荧光淬灭，不适合流式检测长期保存：可参考细胞和组织的冻存（深低温或液氮）DNA倍体检测：可用-20度预冷乙醇固定（终浓度>80%），固定时震荡逐滴加入，避免结块，1~2ml/样本，存放于-20度（>1月）注意：已标记荧光的样本和对细胞活力有要求的样本应尽快检测，以免荧光淬灭及细胞活力丧失样本保存荧光标记表面抗原标记：抗体用量106cells/test冻干粉可以0.5~1ug/106cells为起始量脂溶性染料：可直接进入细胞内细胞内抗原标记及水溶性染料：需要膜通透试剂处理膜通透试剂的选择甲醇：中等，可能导致部分蛋白变性

皂素：温和，对细胞形态影响小

Triton-X100：强烈，对细胞形态影响大

商品化试剂：含有上述多种成分，不同组合用途不同荧光素的选择激发波长发射波长激光荧光通道荧光素的选择

CD8-FITCCD8-PECD8-ECDCD8-PC5CD8-PerCPCD8-APCPerCP<FITC<APC<

ECD<PC5<PC7<PE荧光素的强度荧光检测通道之间的干扰FITC(F/PRatio3-5)PE(1/Antikörper)389D240kDECD(F/PRatio1)PC5(F/PRatio1)240kD240kD240kDTexasRed=625DCy5=1500DCy7=1001DPerCP(F/PRatio3-5)35kDAPC(F/PRatio1)105kDPC7(F/PRatio1)荧光素的大小荧光素的选择原则弱表达抗原选择较“明亮”的荧光素细胞内抗原检测优先选择小分子荧光素多色检测时弱表达抗原放在被干扰较小的检测通道，强表达抗原放在对其他通道干扰较小的检测通道表达互相排斥的抗原可以放在相互干扰较大的检测通道共表达的抗原避免放在相互干扰的通道上级抗原检测通道避免对下级抗原检测通道造成干扰SILENTUNTOUCHABLEUNTOUCHABLEUntouchable=其他染料没有干扰(cleanrow)Silent=不会漏进其他通道(cleancolumn)Distortion矩阵荧光补偿的调节

软件的手动、自动补偿和离线补偿

FL2-%FL1FL-1(FITC)FL-2(PE)FL1-%FL2自动补偿2134检测的一般步骤设置检测方案（PROTOCOL)染色标本（同型对照，补偿管，检测抗体）同型对照管调电压电压不变，补偿管调补偿电压不变，补偿不变，上检测管检测后直接阅读结果，确定分选目的细胞流式细胞仪基本结构Fluidicsopticselectronicsanalyzer液流系统Fluidics流体动力学聚焦原理管路设计光路系统激光滤光片光信号检测器MoFloXDP光路精致设计，开放性强Filter前向散射角（FS）侧向散射角（SS）电路系统如何看图DotPlot（双参数点图）Histogram（单参数直方图）Region（门）Statistics（统计结果）分选系统电极板分选仓分选原理（电荷式分选）晶体震动（200kHZ)液流充电系统高压偏转收集装置（管、孔板）MoFlo™XDP：喷嘴种类多，适合不同研究对象的需要

CytoNozzle

同等大小的罗纹卸载和安装，简单易用喷嘴内壁由生物活性材料组成，对细胞无损伤，确保最好的细胞活性XDP细胞√染色体/精子/细菌/大病毒颗粒/藻类细胞（50um）√实验动物细胞/人淋巴细胞/神经细胞（70-90um）√肿瘤细胞（100-130um）√巨噬细胞等真核生物细胞（150um）√植物/花粉/大藻类细胞（200um）Enrichmode要得到所有含有目标细胞的液滴Purifymode要得到所有含有目标细胞的液滴，但同时含有非目标细胞的液滴除外Singlemode只要只含有一个目标细胞的液滴目标细胞非目标细胞MoFlo:高度智能的分选模式Dropletscells液滴模式(Envolope)如下原则EnrichModeEnrichModePurifyModePurifyMode四路分选可以分别选择不同的分选模式独家的混合分选模式：四路分选分别选择不同的模式

既有高纯度细胞，又不浪费任何一个细胞XDPDataunpublishedShanghai右路：富集模式左路：纯化模式Sortedat>70,000epsfor>2hrs

如何设门1.远离碎片，便于圈门2.分群不清晰，加大电压软件去除粘细胞适合所有应用的细胞接收系统

分选角度定位

4路分选Cyclone克隆分选装置支持任意厂家的标准6,24,96,384,1536微孔板,客户定制的微孔板,波片客户任意指定矩阵的细胞芯片，并且操作简单SummitSoftwareWindowsXP

系统SUMMIT软件涵盖所有的数据和图形处理功能SUMMIT软件以数据库储存为基础，支持自动补偿，离线补偿，多文件分析报告等最先进流式软件性能SUMMIT软件完全开放安装，可以分析所有国际标准LMD/FCS数据，方便使用SUMMIT软件界面简单，易学易用SUMMIT软件独有单参数图颜色示踪功能软件对分选效果的影响软件放大功能流式细胞仪的应用支持最全面的生命科学研究内容免疫功能研究（包括淋巴细胞亚群分析、细胞绝对计数、细胞活化、细胞因子、调节性T细胞、树突细胞、抗原特异性T细胞、Th17细胞等）肿瘤相关研究（肿瘤相关基因表达、抗肿瘤药物作用机制及多药耐药等）细胞周期和DNA倍体分析、细胞周期蛋白干细胞研究（干细胞的分离、鉴定、功能分析等）细胞治疗药物筛选、抗体研发，疫苗评估细胞凋亡及凋亡相关蛋白细胞增殖、转染效率检测磷酸化蛋白的检测及信号传导通路的研究细胞生理功能研究（死活鉴定、细胞内pH值、细胞内钙流、膜电位）细胞多色分选0.0017%极低含量的肝癌细胞系HuH7干细胞分析分选。获取数量超过1300万细胞，CD133阳性细胞含量低于1/10万（0.0017%），总共收集到100多个细胞，直接注射裸鼠皮下进行成瘤观察Unpulisheddatashanghai极低含量的目标细胞（十万分之一）需要一次性海量获取样本细胞才能检测到和分选到淋巴细胞亚群的分析和分选T淋巴细胞(CD3+)名称功能CD3+CD4+辅助性/诱导性T细胞(Th/Ti)辅助和诱导细胞免疫和体液免疫CD3+CD4+CD29+CD3+CD4+CD29-辅助性T细胞(Th)诱导性T细胞(Ti)辅助细胞免疫和体液免疫诱导细胞免疫和体液免疫CD3+CD8+抑制性/杀伤性T细胞(Ts/Tc)抑制免疫反应/杀伤异源细胞CD3+CD8+CD28-CD3+CD8+CD28+抑制性T细胞(Ts)杀伤性T细胞(Tc)抑制细胞和体液免疫细胞毒性T细胞CD3+CD4+CD8+活化的T细胞在T细胞恶性增生时升高CD3+CD4-CD8-有调节功能的T细胞,其表达/T细胞受体(TCR/)CD4+/CD8+比值CD45RA+CD45RO-幼稚的/静止的T淋巴细胞当免疫系统没有能力更新辅助性或抑制性/细胞毒性淋巴细胞的祖细胞时此细胞亚群较低CD45RA-CD45RO+记忆性T淋巴细胞病菌感染时升高,但在慢性病毒感染,如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+活化的T细胞,感染时升高感染时升高活化T淋巴细胞名称功能CD3+HLA-DR+活化T细胞CD4+HLA-DR+活化的辅助性/诱导性T细胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/杀伤性T细胞CD4+CD25+活化的辅助性/诱导性T细胞CD8+CD25+CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性/杀伤性T细胞在病毒感染的患者中增加;其增加意味着HIV患者的预后较差B淋巴细胞(19+)CD19+CD23+活化的B细胞过敏患者中升高

CD19+CD5+在自身免疫性疾病中升高

CD19+CD5+CD23+慢性B细胞白血病及单克隆B淋巴细胞

NK细胞CD3+CD(16+56)+自身免疫性疾病时降低,而病毒感染时升高

CD3+CD57+CMV(巨细胞病毒)感染的强烈征兆

注意事项1.裂红完全SSFS2.CD45/SS设门分选CD44FITC/CD133PE细胞(肿瘤干细胞）从香港空运到上海的手术肿瘤切块，分离成单个细胞后进行染色、检测和分选MoFloXDP，二军大分选后的细胞皮下注射研究干细胞致瘤性SortedCD44SortedCD133两个月后结果：表达CD44的细胞的致瘤性强于表达CD133的细胞MoFloXDP，二军大细胞周期分析/DNA含量分析G0/G1SG2/MG0：静止期，G1：DNA合成前期，S：DNA合成期G2：DNA合成后期，M：有丝分裂期推荐设门：注意事项：1.“细胞去哪里了”？2.固定必须用70%冰乙醇，固定时间2h以上3.乙醇清洗干净，否则影响RNase的