菌种保藏赤峰工业职业技术学院

菌种保藏菌种的保藏

菌种是重要的生物资源，研究和选择良好的菌种保藏方法具有重要的意义。一、菌种保藏的目的

菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、二、菌种保藏的原理首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。其次应人为地创造环境条件（如：干燥、低温和缺氧），使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株三、菌种保藏方法各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一样。一种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。

斜面低温保藏法甘油冷冻管保藏法试管熔封（密封）保藏法石蜡油封藏法砂土管保藏法麸皮保藏法冷冻真空干燥保藏法液氮超低温保藏法（一）斜面低温保藏法－常用保藏法将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全

后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏

期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，

如此连续。此法适用于细菌、霉菌、酵母菌及放线菌保藏短期保藏.此法的主要保藏措施是低温。一般可保存1～6个月左右。优点：简便易行、容易推广，适用于大多数微生物缺点：菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短；传代次数多；菌种容易发生变异和被污染。大肠杆菌斜面金黄色葡萄球菌斜面生孢梭菌白色念珠菌

需气菌、厌气菌培养基真菌培养基（二）甘油冷冻管保藏法将待保藏菌种接种在适宜的斜面培养基上，适宜温度下培养适宜时间后，用无菌接种环轻轻刮取菌苔，通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦使细菌充分扩散到预先装于试管中的无菌蒸馏水中，调正菌液浓度，使其等同于麦氏比浊管第10号管，向已制备好的菌悬液中加入等体积、浓度为20%的无菌甘油，得到10%甘油菌悬液。轻轻振摇小管，使内容物充分混合，分装无菌小管，最好在-30℃条件下储存，一般可保存2年.（三）试管熔封（密封）保藏法熔封用各种琼脂斜面（普通肉汤等）常规灭菌后，经接种，室温培养24～48h后，将接种菌生长旺盛的试管用喷灯将其管口熔封，分别置室温和冰箱下保存。使用时，用砂轮在管口划一圈，在乙醇灯下火烟灭菌后敲开管口即可转接到另一斜面上。室温保存期可达3年，特别是适宜一些因培养物陈旧极易死亡的铜绿假单菌。密封

将需保存种菌按无菌操作要求接种至固体培养基塞紧棉塞，放在干燥器内，干燥器密封处涂上凡士林，盖紧后使之与真空泵相连接。开动真空泵抽真空30min至1h（真空度约为640）关闭密封口，拨出胶塞，置于室温下保存。待用时，打开盖，取出种菌，接种至培养基上即可。（四）石蜡油封藏法此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端1cm，使培养物与空气隔绝，加硅胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。此法的主要保藏措施是低温、阻氧。一般可保存1～2年左右。（五）冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即熔封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。此法适用于各大类微生物。此法的主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、有保护剂，保藏期一般长达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。（六）液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（－196℃）下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。此法适用于各种微生物菌种的保藏。此法的主要保藏措施是超低温、有保护剂，保藏期一般可达到15年以上，是目前公认的最有效的菌种长期保藏技术之一。此法的优点是操作简便、高效，且可使用各种培养形式的微生物进行保藏。其缺点是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。菌种的保藏条件及时间菌种培养基保存条件及时间大肠埃希菌营养琼脂培养基4℃~6℃保存2~3个月金黄色葡萄球菌营养琼脂培养基4℃~6℃保存2~3个月枯草芽孢杆营养琼脂培养基4℃~6℃保存3~6个月铜绿假单胞菌营养琼脂培养基室温沙门菌营养琼脂培养基4℃~6℃保存2~3个月生孢梭菌硫乙醇酸盐培基4℃~6℃保存6个月以上白色念珠菌改良马丁培养基4℃~6℃保存4~6个月黑曲霉改良马丁培养基4℃~6℃保存4个月菌液的制备取铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中，生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中置35～37℃细菌培养箱培养18～24h；白色念珠菌的新鲜培养物少许

接种至改良马丁培养基中置23～28℃霉菌

培养箱培养48h。黑曲霉的菌液制备：

将黑曲霉的孢子接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，于23～28℃霉菌培养箱培养5～7天，使大量的孢子产生。加入3～5ml的0.9%无菌氯化钠溶液，用无菌玻棒或接种环轻轻将孢子洗脱，然后，用一支管口塞有无菌棉花的无菌球形毛细吸管吸出孢子菌液至无菌试管内，可用比浊法或玫瑰红钠琼脂培养基注皿（1ml），按规定条件培养后计数。菌液的稀释方法细菌的生长曲线细菌群体的生长繁殖可分为四期：

一期：迟缓期（lagphase）

细菌接种至培养基后，对新环境有一个短暂适应过程（不适应者可因转种而死亡）。此期曲线平坦稳定，因为细菌繁殖极少。迟缓期长短因种类、接种菌量、菌龄以及营养物质等不同而异，一般为1～4小时。此期中细菌体积增大，代谢活跃，为细菌的分裂增殖合成、储备充足的酶、能量及中间代谢产物。

二期：对数期(logarithmicphase)

又称指数期(exponentialphage)。此期生长曲线上活菌数直线上升。细菌以稳定的几何级数极快增长，可持续几小至几天不等（视培养条件及细菌代时而异）。此期细菌形态、染色、生物活性都很典型，对外界环境因素的作用敏感，因此研究细菌性状以此期细菌最好。抗生素作用，对该时期的细菌效果最佳。三期：稳定期（stationaryphase）

该期的生长菌群总数处于平坦阶段，但细菌群体活力变化较大。由于培养基中营养物质消耗、毒性产物（有机酸、H2O2等）积累ph下降等不利因素的影响，细菌繁殖速度渐趋下降，相对细菌死亡数开始逐渐增加，此期细菌增殖数与死亡数渐趋平衡。细菌形态、染色、生物活性可出现改变，并产生相应的代谢产物如外毒素、内毒素、抗生素、以及芽胞等。四期：衰亡期（declinephase）

随着稳定期发展，细菌繁殖越来越慢，死亡菌数明显增多。活菌数与培养时间呈反比关系，此期细菌变长肿胀或畸形衰变，甚至菌体自溶，难以辩认其形。生理代谢活动趋于停滞。故陈旧培养物上难以鉴别细菌。

细菌的分离培养技术—平板划线分离法一.连续划线分离法：此法用于含菌量少的菌液。先将培养物于平板1/5处密集涂布，然后来回做曲线连续划线接种，线于线之间有一定的距离，划满平板为止。二.分区划线分离法：此法用于含菌量多的菌液。先将培养物涂布于平板表面边缘第一区，约占平板1/5面积，再在二、三、…区依次连续划线。每划完一个区，均将接种环灭菌一次。每一区的划线均接触上一区的接种线1~2次，使菌量逐渐减小，以获得单个菌落。细菌分离培养的直观图纯培养

所谓微