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课题2土壤中分解尿素细菌的分离与计数一、基础知识：1、尿素的利用尿素[CO(NH2)2]——重要的农业氮肥。土壤中细菌将其分解为NH3才能被植物吸收利用。2、土壤中的细菌能利用尿素的原因:土壤中的尿素分解菌菌能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH3再通过平板划线法或稀释涂布平板法对目的菌进行分离和纯化。3、实验室中微生物的筛选原理：

利用选择培养基，人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，促进目的菌株的生长，同时抑制或阻止其他微生物生长。15.0g琼脂1.0g尿素(唯一N源)10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNa2HPO41.4gKH2PO4筛选尿素分解菌的选择培养基：（下列物质溶解后，定容至1000mL）4.统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不适于具有运动性的细菌的计数；需要较高的细菌浓度；显微镜下难以观察个体小的细菌；缺点：(1)显微镜直接计数(血细胞计数板)(2)间接计数(1)显微镜直接计数(血细胞计数板)2.间接计数法（活菌计数法）⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个细胞。⑵常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的菌落的平均数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。计算公式：每克样品中的菌株数=（C÷V）×M某同学在稀释倍数为106

的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）()A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4B注意事项①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。②为使结果更接近真实值可将同一稀释度的土壤稀释液涂布到三个或三个以上的平板中，并求平均值。③由于菌落间有粘连，因此统计的菌落数往往比实际的活菌数低。二、实验过程

（一）配制土壤溶液

1、土壤取样：铲去表层土取样。2、将10g土样溶于90mL无菌水，制成101的稀释液。

（四）菌落鉴定（一）配制土壤溶液（二）系列稀释（三）涂布平板与培养、观察（二）样品稀释（酒精灯火焰旁进行）（1）测细菌数：一般用104、105、106稀释液（2）测放线菌：一般用103、104、105稀释液（3）测真菌数：一般用102、103、104稀释液原则：确保平板上的菌落数在30∼300之间。（三）涂布平板与培养、观察1、涂布：用适当的稀释液做涂布平板（火焰旁）2、培养：细菌：30∼37℃，1∼2d;

放线菌:25∼28℃,5∼7d;

霉菌:25∼28℃,3∼4d.3、观察：a.每24h统计一次菌落数目b.以“稳定菌落”为观察对象，防止因培养时间不足而遗漏菌落。

（四）鉴定--鉴别培养基（不影响微生物的生存）

鉴定尿素分解菌的培养基---酚红培养基

原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→酚红变红CO(N

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