透明质酸、硫酸软骨素香菇多糖

第八章糖类药物制备原理1糖科学蛋白核酸糖类生物化学最后的巨大前沿之一2第一节概述糖类广布于生物体中，可分为单糖、低聚糖和多糖，已发现不少糖类物质及其衍生物具有很高药用价值，有些已在临床广泛应用。多糖类药物近来很引人注目，尤其在抗凝、降血脂、提高机体免疫和抗肿瘤、抗辐射方面都具有显著药理作用与疗效。如PS-K多糖和香菇多糖对小鼠S180瘤株有明显抑制作用，已作为免疫型抗肿瘤药物，猪苓多糖能促进抗体的形成，是一种良好免疫调节剂，还有茯苓多糖、云芝多糖、银耳多糖、胎盘脂多糖等都已在临床上应用。肝素是天然抗凝剂，用于防治血栓、周围血管病、心绞痛、充血性心力衰竭与肿瘤的辅助治疗。硫酸软骨素有利尿、解毒、镇痛作用。3糖类药物的分类单糖糖的衍生物多糖低聚糖葡萄糖、果糖、氨基葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、乳果糖6-磷酸葡萄糖、1,6-二磷酸葡萄糖磷酸肌醇香菇多糖、肝素等4Text1Text3Txt5植物动物微生物海藻多糖的分类〔按照其来源不同来分〕黄芪多糖、人参多糖、刺五加多糖肝素、透明质酸、硫酸软骨素香菇多糖、灵芝多糖、猪苓多糖海带多糖、微藻多糖5多糖在细胞内的存在方式游离型结合型：

糖蛋白：如人参多糖、黄芪多糖等

脂多糖：如胎盘脂多糖、细菌脂多糖等。6多糖类药物的药理活性抗氧化

调节血糖血脂

抗辐射损伤抗溃疡调节免疫功能抗病毒

抗突变

抗衰老抗肿瘤抗凝血

香菇、海带、冬虫夏草泥鳅、银杏叶多糖硫酸多糖类肝素、甲壳素、海带多糖7国内已经上市的多糖药物8一、单糖及其衍生物的制备游离单糖及小分子寡糖易溶于冷水及温乙醇，如葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、双糖类如蔗糖、麦芽糖，三糖类如棉籽糖、龙胆糖，四糖类如来苏糖，以及多元醇类，如卫矛醇、甘露醇等。可以用水或在中性条件下以50%乙醇为提取溶剂，也可以用82%乙醇，在70~78℃下回流提取。用中性醋酸铅去杂蛋白及其他杂质，单糖或小分子寡糖也可以在提取后，用吸附层析法或离子交换法进行纯化。9二、多糖的别离与纯化多糖可来自动物、植物和微生物。植物体内含有水解多糖衍生物的酶，必须抑制或破坏酶的作用后，才能制取天然存在形式的多糖。供提取多糖的材料必须新鲜或及时枯燥保存，不宜久受高温，以免破坏其原有形式，速冻冷藏是保存提取多糖材料的有效方法。提取方法依照不同种类的多糖的溶解性质而定。如昆布多糖、果聚糖、糖原易溶于水；壳多糖与纤维素溶于浓酸；直链淀粉易溶于稀碱；酸性粘多糖常含有氨基已糖、已糖醛酸以及硫酸基等多种结构成分，且常与蛋白质结合在一起，提取别离时，通常先用蛋白酶或浓碱、浓中性盐解离蛋白质与糖的结合键后，用水提取，再将水提取液减压浓缩，以乙醇或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀酸性多糖，最后用离子交换色谱进一步纯化。10〔一〕多糖的提取提取多糖时，一般先需进行脱脂，以便多糖释放。方法是将材料粉碎，用甲醇或1：1乙醇乙醚混合液，加热搅拌1~3h，也可用石油醚脱脂。动物材料可用丙酮脱脂、脱水处理。多糖的提取方法主要有以下几种。

1.难溶于冷水、热水，可溶于稀碱液者2.易溶于温水、难溶于冷水和乙醇者3.粘多糖

111.难溶于冷水、热水，可溶于稀碱液者这一类多糖主要是不溶性胶类，如木聚糖、半乳聚糖等。用冷水浸润材料后用0.5mol/LNaOH提取，提取液用盐酸中和、浓缩后，加乙醇沉淀得多糖。如在稀碱中仍不易溶出者，可参加硼砂，对甘露聚糖、半乳聚糖等能形成硼酸络合物的多糖，此法可得相当纯的物质。2.易溶于温水、难溶于冷水和乙醇者材料用冷水浸过，用热水提取，必要时可加热至80~90℃搅拌提取，提取液用正丁醇与氯仿混合液除去杂蛋白(或用三氯乙酸除杂蛋白)，离心除去杂蛋白后的清液，透析后用乙醇沉淀得多糖。123.粘多糖粘多糖：是指含有氨基糖与糖醛酸或它的衍生物的多糖。是含氮的不均一多糖，是构成细胞间结缔组织的主要成分，也广泛存在于哺乳动物各种细胞内，也称为糖胺聚糖。特点：是一种长链复合糖分子，由己糖醛酸和氨基己糖或中性糖组成的二糖单位彼此相连而形成，可与蛋白质相连形成蛋白多糖

。13〔1〕碱解法多糖与蛋白质结合的糖肽键对碱不稳定，故可用碱解法使糖与蛋白质分开。碱处理时，可将组织在40℃以下，用0.5mol/LNaOH溶液提取，提取液以酸中和，透析后，以高岭土、硅酸铝或其他吸附剂除去杂蛋白，再用乙醇沉淀多糖。粘多糖分子上的硫酸基一般对碱较稳定，但假设硫酸基与邻羟基处于反式结构或硫酸基在C-3或C-6，此时易发生脱硫作用。如肝素、硫酸乙酰肝素的氨基葡萄糖C-6上有硫酸基，C-3上可为游离羟基或硫酸基，因此对这类多糖不宜用碱解法提取。14〔2〕酶解法蛋白酶水解法已逐步取代碱提取法而成为提取多糖的最常用方法。蛋白酶不能断裂糖肽键及其附近的肽键，因此成品中会保存较长的肽段。为除去长肽段，常可与碱解法合用。酶解时要防止细菌生长，可加甲苯、氯仿、酚或叠氮化钠作抑菌剂，常用的酶制剂有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和链霉菌蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶。酶解液中的杂蛋白可用三氯醋酸法，磷钼酸—磷钨酸沉淀法，高岭土吸附法、三氟三氯乙烷法，等电点法去除，再经透析后，用乙醇沉淀即可制得粗晶粘多糖。15〔二〕多糖的纯化多糖的纯化方法很多，但必须根据目的物的性质及条件选择适宜的纯化方法。且用一种方法不易得到理想的结果，因此必要时应考虑合用几种方法。1.乙醇沉淀法2.分级沉淀法3.季胺盐络合法4.离子交换层析法此外，区带电泳法、超滤法及金属络合法等在多糖的别离纯化中也常采用。如应用区带电泳法可别离透明质酸、硫酸软骨素与肝素等。161.乙醇沉淀法乙醇沉淀法是制备粘多糖的最常用手段。乙醇的参加，改变了溶液的极性，导致糖溶解度下降。供乙醇沉淀的多糖溶液，其含多糖的浓度以1~2%为佳。如使用充分过量的乙醇，粘多糖浓度少于0.1%也可以沉淀完全。向溶液中参加一定浓度的盐，如醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵或氯化钠有助于使粘多糖从溶液中析出，盐的最终浓度5%即足够。使用醋酸盐的优点是在乙醇中其溶解度更大，即使在乙醇过量时，也不会发生这类盐的共沉淀。一般只要粘多糖浓度不太低，并有足够的盐存在，加人4~5倍乙醇后，粘多糖可完全沉淀。可以使用屡次乙醇沉淀法使多糖脱盐，也可以用超滤法或分子筛法(SephadexG-10或G-15)进行多糖脱盐。加完酒精，搅拌数小时，以保证多糖完全沉淀。沉淀物可用无水乙醇、丙酮、乙醚脱水，真空枯燥，即可得疏松粉末状产品。172.分级沉淀法不同多糖在不同浓度的甲醇、乙醇或丙酮中的溶解度不同，因此可用不同浓度的有机溶剂分级沉淀分子大小不同的粘多糖。在Ca2+、Zn2+等二价金属离子的存在下，采用乙醇分级别离粘多糖可以获得最正确效果。183.季胺盐络合法粘多糖与一些阳离子外表活性剂如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和十六烷基氯化吡啶(CPC)等能形成季胺盐络合物。这些络合物在低离子强度的水溶液中不溶解，在离子强度大时，这种络合物可以解离，溶解，释放。使其溶解度发生明显改变时的无机盐浓度，主要取决于聚阴离子的电荷密度。粘多糖的硫酸化程度影响其电荷密度，根据其临界盐浓度的差异可以将粘多糖分为假设干组〔表8-1P191〕。降低pH可抑制羧基的电离，有利于增强硫酸粘多糖的选择性沉淀。季胺盐的沉淀能力受其烷基链中的“-CH2-〞基数的影响，还可以用不同种季胺盐的混合物作为酸性粘多糖的别离沉淀剂，如Cetavlon和Arguadl6等。应用季胺盐沉淀多糖是分级别离复杂粘多糖与从稀溶液中回收粘多糖的最有用方法之一。194.离子交换层析法粘多糖由于具有酸性基团如糖醛酸和各种硫酸基，在溶液中以聚阴离子形式存在，因而可用阴离子交换剂进行交换吸附。常用的阴离子交换剂有D254，Dowex-X2，ECTEOIA-纤维素，DEAE-C，DEAE-SephadexA-25和DeaciditeFF。吸附时可以使用低盐浓度样液，洗脱时可以逐步提高盐浓度如梯度洗脱或分步阶梯洗脱。以DowexⅠ进行别离时，分别有0.5，1.25，1.5，2.0和3.0mol/LNaCl洗脱，可以别离透明质酸、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、肝素和硫酸角质素。以DEAE-sephadexA-25层析时，分别用0.5，1.25，1.5和2.0mol/LNaCl洗脱，可以依次别离透明质酸、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素与硫酸角质素和肝素。20多糖别离纯化的一般方法脱脂三种方法黏多糖乙醇沉淀分级沉淀21断开与蛋白相连的结合键试剂〔氯仿：戊醇5：1〕，作用是使蛋白质变性，缺点多糖损失较多黏多糖在溶液中以聚阴离子形式存在，故采用阴离子交换剂吸附。最常用手段22第二节糖类药物生产工艺糖类药物品种繁多，开展迅速，现根据其来源、性质及工艺特点不同，主要介绍具有代表性的几个重要品种的生产工艺。一、D-甘露醇的制备。二、肝素的制备三、硫酸软骨素的制备四、透明质酸的制备23一、D-甘露醇〔D-Mannitol〕的制备〔一〕结构与性质甘露醇又名己六醇，白色针状结晶，无臭，略有甜味，不潮解。易溶于水〔15.6g18℃〕溶于热乙醇，微溶于低级醇类和低级胺类，微溶于吡啶，不溶于有机溶剂。在无菌溶液中较稳定，不易为空气所氧化。溶点166℃，[α]20D+28.6°(硼砂溶液)。24〔二〕生产工艺甘露醇在海藻、海带中含量较高。海藻洗涤液和海带洗涤液中甘露醇的含量分别为2%与1.5%，是提取甘露醇的重要资源。以葡萄糖为原料，经电解、脱盐、精制即可制得，电解转化率为98~99.6%，也可以用发酵法生产。1.提取法2.发酵法3.制剂25

1.提取法〔1〕工艺路线20倍量自来水，室温浸泡2~3h，浸泡液套用4批

甘露醇在医药上是良好的利尿剂，降低颅内压、眼内压及治疗肾药、脱水剂、食糖代用品、也用作药片的赋形剂及固体、液体的稀释剂。

甘露醇注射液作为高渗透降压药，是临床抢救特别是脑部疾患抢救常用的一种药物，具有降低颅内压药物所要求的降压快、疗效准确的特点。26二、肝素〔Heparin〕的制备〔一〕结构与性质肝素首先从肝脏发现而得名，天然操作于肥大细胞，现在主要从牛肺或猪小肠黏膜提取。肝素是天然抗凝剂,是一种含硫酸基的酸性粘多糖。三硫酸双糖与二硫酸双糖以2：1比例在分子中连结。三硫酸双糖中是L-艾杜糖醛酸,二硫酸双糖中是D-葡萄糖醛酸27肝素的性质分子量不均一，有高中低三类不同分子量组成，平均分子量12000±6000，从3000-37500。易溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂，其游离酸在乙醚中有一定溶解性。含硫酸基和羧基，呈强酸性，为聚阴离子。N-硫酸基对酸敏感，在碱性条件稳定。28〔二〕生产工艺肝素广泛分布于哺乳动物的肝、肺、心、脾、肾、胸腺、肠粘膜、肌肉和血液里。因此肝素可由猪肠粘膜、牛肺、猪肺提取。其生产工艺主要有盐解—季胺盐沉淀法，盐解-离子交换法和酶解-离子交换法。肝素在组织内和其他粘多糖一起与蛋白质结合成复合物，因此肝素制备过程包括肝素蛋白质复合物的提取，解离和肝素的别离纯化两个步骤。提取肝素多采用钠盐的碱性热水或沸水浸提，然后用酶如胰蛋白酶、胰酶(胰脏)、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和细菌蛋白酶等水解与肝素结合的蛋白质，使肝素解离释放。也可以用碱性食盐水提取，再经热变性并结合凝结剂如明矾、硫酸铝等除去杂蛋白。所得的粗提液，仍含有未除尽的杂蛋白、核酸类物质和其他粘多糖，需经阴离子交换剂或长链季胺盐别离，再经乙醇沉淀和氧化剂处理等纯化操作，即得精品肝素。29肝素生产工艺P19695℃，10min碱性食盐水，加热提取95％碱性，阴离子吸附剂先用水洗至澄清，再用2倍量30肝素生产工艺2.酶解-离子交换生产工艺猪肠粘膜【酶解】胰浆、NaCl、Ph8.5、40－45℃Ph6.5、90℃滤液【吸附】D-254树脂Ph7.0、5h树脂吸附物【洗涤】2mol/LNaCl1.2mol/LNaCl【洗脱】洗脱液树脂吸附物5mol/LNaCl3mol/LNaCl【沉淀】沉淀物乙醇【脱水、枯燥】肝素粗品无水乙醇、丙酮【溶解】【脱色】2％NaClKMnO4Ph8.0、80℃/2.5h滤液【沉淀】沉淀物乙醇、Ph6.4【溶解】2％NaCl溶液【沉淀】沉淀物乙醇【脱水、枯燥】无水乙醇、丙酮、乙醚精品肝钠素31肝素的药理作用肝素的药理作用：

1、抗凝血。

2、抑制血小板，增加血管壁的通透性，并可调控血管新生。

3、具有调血脂的作用。

4、可作用于补体系统的多个环节，以抑制系统过度激活。与此相关，肝素还具有抗炎、抗过敏的作用。肝素的不良反响：肝素的主要不良反响是易引起自发性出血，表现为各种黏膜出血、关节腔积血和伤口出血等，而肝素诱导的血小板减少症是一种药物诱导的血小板减少症，是肝素治疗中的一种严重并发症。肝素的特效解毒剂：鱼精蛋白。32三、硫酸软骨素的制备(一)结构与性质硫酸软骨素(CS)的药用商品名为康得灵，是从动物软骨中提取制备的酸性粘多糖，主要是硫酸软骨素A、C及各种硫酸软骨素的混合物。硫酸软骨素一般含有50~70个双糖单位，链长不均一，分子量在1~3万。易溶于水而成粘度大的溶液，不溶于乙醇、丙酮和乙醚等有机溶剂中，其盐对热较稳定，受热80℃亦不破坏。具有调脂、抗炎及弱的抗凝血、抗血栓生物活性，对维持细胞环境的相对稳定性和正常功能具有重要作用。33(二)生产工艺硫酸软骨素广泛存在于动物的软骨、喉骨、鼻骨，牛、马鼻中隔和气管中，在骨腱、韧带、皮肤、角膜等组织中也有。鱼类软骨中含量也很高，如鲨鱼骨中含50~60%。在软骨中，硫酸软骨素与蛋白质结合成蛋白多糖，并与胶原蛋白结合在一起。其提取别离方法有稀碱-酶解法、浓碱水解法、稀碱-浓盐法、酶解-树脂法。341.稀碱-浓盐法

2.稀碱-酶解法35四、透明质酸(HyaluronicAcid)的制备(一)结构与性质透明质酸是由(1→3)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖-(1→4)-O-β-D-葡萄糖醛酸的双糖重复单位所组成的酸性多糖，分子量50~200万。溶于水，不溶于有机溶剂，具有较高的粘度特性。对骨关节具有润滑作用。还能促进物质在皮肤中的扩散率、调节细胞外表和细胞周围的Ca2+，Mg2+，K+，Na+离子运动。在组织中的强力保水作用是其最重要的生理功能之一，故被称为理想的天然保湿因子。36(二)生产工艺制备透明质酸的常用原料有公鸡冠、眼球玻璃体、人脐带、猪皮、兔皮等。工艺过程包括提取，除蛋白等杂质，分级别离，有机溶剂沉淀等。纯化方法有离子交换层析法、制备电泳法、凝胶过滤法和吸附法等。第九章37糖类简介介绍：糖类是自然界中广泛分布的一类重要的有机化合物。日常食用的蔗糖、粮食中的淀粉、植物体中的纤维素、人体血液中的葡萄糖等均属糖类。糖类在生命活动过程中起着重要的作用，是一切生命体维持生命活动所需能量的主要来源。

构成：主要由碳、氢、氧三种元素构成。

糖类化合物包括单糖、单糖的聚合物及衍生物。

分子通式：Cm(H2O)n

然而，符合这一通式的不一定都是糖类，是糖类也不一定都符合这一通式。

这只是表示大多数糖的通式。

碳水化合物只是糖类的大多数形式。我们把糖类狭义的理解为碳水化合物。