实验四 感受态细胞的制备

《分子生物学实验》实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备分子生物学实验实验四大肠杆菌感受态细胞的制备实验结果与讨论实验步骤实验仪器与试剂实验原理实验目的分子生物学实验实验目的1、掌握大肠杆菌感受态细胞的制备原理。2、学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的方法和技术。分子生物学实验实验原理

1、感受态细胞制备原理：受体细胞经过一些特殊方法(如电击法、CaCl2、RbCl等化学试剂法)处理后，细菌会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenentcells)。（Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域）分子生物学实验2、感受态转化原理：细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，细胞膜的通透性发生变化，同时转化混合物中的质粒DNA会形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经过42℃短时间的热激处理，促进感受态细胞吸收DNA复合物，在培养液中生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，在选择培养基上可获得所需的转化子。抗Amp宿主细菌含Amp培养基实验仪器超净工作台离心设备台式高速冷冻离心机制冰机分子生物学实验实验试剂1、实验材料：E.

coliJM109。2、实验试剂：LB液体培养基：称取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，加双蒸水至总体积1L，高压下蒸气灭菌。(2)0.1mol/LCaCl2溶液：称取1.1098gCaCl2(无水,分析纯)，溶于90mL重蒸水中，定容至100mL，高压灭菌。(3)30%甘油：量取30mL甘油，加入70mL双蒸水，混匀，定容至100mL，高压灭菌。分子生物学实验实验步骤菌体的培养(事先已做)受体菌的培养从

LB平板上挑取新活化的E.coli

JM109单菌落，接种于3～5

mLLB液体培养基中，37℃下振荡培养

12hr左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以

1:

100～1:

50

的比例接种于50mLLB液体培养基中，37℃振荡培养2～3hr，至OD600为0.3～0.4。分子生物学实验取2个1.5mL离心管，分别转入1mL菌液，4℃12000rpm，离心2min。弃去上清，每管加入1mL预冷的

0.1mol/L

CaCl2

溶液，悬浮细胞，冰上放置

30min。4℃

，12000rpm，离心2min。弃去上清，每管加入50μL预冷的0.1mol/LCaCl2

溶液，轻缓悬浮细胞,50μL预冷的30%甘油，冰上放置5min，即为感受态细胞悬液。将感受态细胞悬液，放置于-80℃，可保存半年。2.感受态细胞的制备(CaCl2

法，超净台内)分子生物学实验第二天，CaCl2

法前一天晚上，第二天早上菌体的活化感受态的制备分子生物学实验每人2管感受态细胞结果分子生物学实验注意事项细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监测培养液的OD600来控制。JM109菌株的OD600为0.3－0.4密度比较合适，密度过高或不足均会影响转化效率。实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔