第二章 细胞分离等-生物工程下游技术

第二章发酵液预处理，细胞的分离、破碎第一节发酵液预处理目的：分离菌体和其他悬浮颗粒；除去部分杂质和改变滤液性质发酵液的性质：产物浓度较低悬浮颗粒小固体粒子可压缩性大粘度大性质不稳定第一节发酵液预处理常用的发酵液预处理方法：降低液体的粘度：水稀释法、加热法调整pH值凝聚和絮凝凝聚：在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，从而胶体体系不稳定。絮凝：在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。

混凝：前两者的复合使用。第一节发酵液预处理加入助滤剂助滤剂：不可压缩的多孔微粒。硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩等。悬浮液中大量的细微粒子吸附到助滤剂的表面上，其可压缩性下降了，滤饼疏松，过滤阻力降低了。加入不影响目的产物的反应剂第二节细胞分离A.重力沉降：细胞体积小，沉降速度很慢使细胞聚集成较大的凝聚颗粒，提高沉降速度

高分子絮凝剂：聚丙烯酰胺、聚乙烯酰胺等无机的凝聚剂：中性盐（硫酸铝、氯化钙等）细胞分离—B.离心沉降离心分离法：

1.差速离心（Differentialcentrifugation）

生化工业中最常用的离心分离法，细胞的分离为一级分级分离。实际应用中据实际物系的特点、分离目的和所需分离程度，选择适当的离心机转数和时间，可使料液中不同组分得到分级分离。

2.区带离心（Zonalcentrifugation）

事先在离心管中用某种低分子溶质调配好密度梯度，再加待处理料液后进行离心。离心时，料液中各组分在密度梯度中以不同的速度沉降，形成各自的区带而得到分离。蔗糖、CsCl、NaBr密度梯度溶液细胞分离—B.离心沉降离心分离法：低速离心，高速离心，超速离心过滤式离心，沉降式离心冷冻离心：低温下操作细胞分离—B.离心沉降离心分离设备：实验室用离心机：离心管式转子离心机间歇式操作各种形式的离心机转子细胞分离—B.离心沉降工业用离心机：可连续操作管式离心机，蝶片式离心机管式离心机

管式离心机能澄清及分离流体物质，被应用于化学、生物化学、制药、血浆等研究领域。设备简单，分离效率高；但生产能力较小。碟式离心机碟式离心机是沉降式离心机中的一种，用于分离难分离的物料（例如粘性液体与细小固体颗粒组成的悬浮液或密度相近的液体组成的乳浊液等）。碟式分离机是应用最广的沉降离心机。碟式离心机可以完成两种操作：(1)液-固分离，称澄清操作；(2)液-液（或液-液-固）分离（即乳浊液的分离），称分离操作。细胞分离—C.过滤过滤（Filtration）：

利用多孔性介质截留悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法。

Filtrationseparatessolidfromaliquidbyforcingtheliquid

througha

solid

supportorfiltermedium.

细胞分离—C.过滤通常发酵液的黏度大，其中的微生物体积小，造成过滤的困难

Howeverthesmallsizeofmicroorganismsmakefiltrationof

biologicalsolutionsconsiderablymorecomplicated.Generally,fermentationbeersandotherbiologicalsolutionsarehardtofilterbecauseofthehighviscosityorhighlycompressiblecakes.

在过滤前，一般需对料液进行絮凝或凝聚等预处理，此外可添加助滤剂提高过滤速度。细胞分离—C.过滤过滤方法：澄清过滤，滤饼过滤：P53重力过滤，加压过滤，真空过滤，离心过滤切向流过滤：P57-细胞分离—C.过滤过滤设备：板框过滤机用于各种悬浮液的固液分离，适用范围广。应用于食品、环保、轻工、医药、化工、冶金、石油等工业。特别适用于大批量啤酒、白酒、葡萄酒、食用油等液体饮料的精滤或除菌过滤。板框过滤机细胞分离—C.过滤板框压滤机1.结构：若干板，框交替排列，板，框都用支耳架在一对横梁上，用压紧装置压紧或拉开。2.滤板结构：凹凸纹路作用支撑滤布，提供滤液或洗涤液的流道。分为洗涤板和非洗涤板两种。3.滤框结构：有供料浆通过的暗孔，料浆在压差的推动下籍框两侧覆盖的滤布进行过滤分离。4.过滤操作液体流动路径：料浆沿1通道输入，通过滤框的暗孔进入滤框，框中的料浆在压差的推动下籍框两侧覆盖的滤布进行过滤分离。滤饼在框内两侧生成并增长，滤液通过滤布流到滤板板面的凹槽后因板面凹槽有暗孔与2、4通道相连或与3通道相连，故滤液可由三条通道流到过滤机外。细胞分离—C.过滤硅藻土过滤机：硅藻土的使用方法：作为过滤介质作为支持介质加入到悬浮液中按支撑单元分：板框过滤机，叶片式过滤机等第三节细胞破碎许多生物产物在细胞培养过程中不能分泌到胞外，而保留在细胞内。破碎细胞的目的就是使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏或破碎，释放其中的目标产物。细胞破碎应考虑破碎细胞的结构微生物细胞,

动物细胞,

植物细胞真核细胞：细胞壁成分为纤维素或几丁质，或兼有该两种成分。

不同种类的细胞结构差别很大，破碎的难易程度也不同，由难到易的大致排列顺序为：植物细胞＞真菌（如酵母菌）＞革兰氏阳性细菌＞革兰氏阴性细菌＞动物细胞。革兰氏阳性细菌的细胞壁结构革兰氏阳性（G+）细菌的细胞壁具有较厚（30-40nm）而致密的肽聚糖层，多达20层磷壁酸：是革兰氏阳性菌的特有的成分，可加强肽聚糖的结构。革兰氏阴性细菌的细胞壁革兰氏阴性细菌的外膜壁膜间隙O-特异多糖(O-polysaccharide)核心多糖(core-polysaccharide)蛋白质类脂A(LipidA)孔蛋白(脂多糖)磷脂分子脂蛋白细胞破碎目标产物的选择性释放

选择性释放目标产物，使其他物质尽量少地释放出来，并尽量降低细胞的破碎程度，对下游分离纯化有利。细胞破碎一、机械破碎：

机械破碎的原理是细胞在机械作用力下受到压缩和剪切而破碎。细胞越小，所需压缩或剪切力越大，越难破碎。处理量大、效率高、速度快，是工业规模的主要手段

1.高压匀浆：

破碎原理：主要利用细胞悬液在高压作用下液相剪切力以及细胞与固定表面的撞击力而使之破碎。

压力通常为20-70MPa

适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎需冷却处理，以保护产物的生物活性细胞破碎2.珠磨

破碎原理：利用在高速搅拌作用下，细胞和微球相互磨擦碰撞而破碎。细胞受研磨剪切和撞击而破碎特点：适用范围较广；但有效能量利用率很低，设计操作时应充分考虑冷却系统的热交换能力；影响破碎率的操作参数较多。3.撞击破碎细胞冷冻后成为刚性球体，再进行高速撞击而破碎特点：细胞破碎均匀；可通过调节载气压力控制细胞破碎程度；适用于细胞器（如线粒体、叶绿体）的回收。4.超声波破碎

破碎原理：超声波作用下液体发生空化作用，产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。影响因素：细胞种类、浓度和超声波的能量等。特点：适用范围广,适用于多数微生物细胞的破碎。但有效能量利用率极低，操作中产生热，需在冰水或有外部冷却的容器中进行,故不易放大，多在实验室使用。细胞破碎二、化学和生物化学法1.酸碱处理2.化学试剂处理：增大细胞壁通透性表面活性剂、螯合剂、有机溶剂、变性剂3.酶溶：利用溶解细胞壁的酶处理细胞不同的细胞用不同的酶：如溶菌酶适用于细菌；而酵母细胞的酶溶需用Zymolyase、-1,6-葡聚糖酶或甘露糖酶；破坏植物细胞则用纤维素酶。4.自溶：通过调节温度、pH或添加有机溶剂，诱使细胞产生溶解自身的酶的方法。

机械破碎法与化学破碎法的比较机械破碎法优点：处理量大、破碎效率高、速度快，适用于工业规模的细胞破碎。缺点：由于操作条件比较剧烈，往往容易造成细胞的过度破碎，不利于后续处理。化学破碎法优点：选择性高，胞内产物的总释放率低，料液粘度小，有利于后处理过程。缺点：适用范围小，通用性差，破碎速度慢，处理时间长，破碎效率低，不适于大规模细胞破碎操作。由以上比较可知，两种方法各有利弊，把二者结合起来使用，则可起到取长补短的作用，能够得到很好的破碎效果。细胞破碎三、物理渗透法

1.渗透压冲击法：破碎原理：细胞在高渗透压介质中平衡后，再突然将其转至低渗透压环境中，水会大量进入细胞，使细胞壁和膜胀破。特点:温和，适用于易于破碎的细胞（动物细胞和革兰氏阴性菌）

2.冻结-融化法细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，此操作反复进行多次，使细胞受到破坏。破碎原理：利用细胞在快速冷冻时，细胞内水很快结晶，形成大量晶核，体积增大，将细胞胀破，经冻结－融化反复多次操作，即可达到所需的破碎率。特点：此法主要适用于大肠杆菌和细胞壁较薄的细胞，特别适用于位于胞间质的酶的释放；操作方便，但耗时、耗能，大规模应用困难。细胞破碎细胞破碎破碎率的测定：直接测定法目标产物测定法导电率测定法细胞破碎研究和发展方向：多种破碎方法相结合与下游过程相结合与上游过程相结合：细胞的培养条件、基因工程等包含体的分离和蛋白质复性包含体（inclusionbodies,Ibs）：很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物不分泌到细胞外，而在细胞内凝聚成的无生物活性的固体颗粒。包含体中基因表