第三章 基因的保持：DNA复制与损伤修复

基因的保持Genemaintenance第三章DNA复制与损伤修复ReplicationandRepairofDNA第一节DNA复制(DNAReplication)一、DNA复制概述二、DNA复制相关物质三、DNA复制的起点、方向和速度四、半不连续复制五、DNA的复制过程（大肠杆菌为例）六、DNA复制的其它方式七、真核生物中DNA的复制特点八、DNA复制的调控（自学）主要内容一、

DNA复制概述DNA的复制：以亲代DNA分子为模板合成子代DNA链的过程。DNA复制可能的三种方式半保留全保留弥散型亲代DNA子代DNADNA的半保留复制（semi-conservativereplication）以亲代DNA双链为模板以碱基互补方式合成子代DNA，在新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制。中国科学院上海生化与细胞所2002年招收硕士研究生分子遗传学入学考试：请设计一个实验来证明DNA复制是以半保留方式进行的（8分）。半保留复制的实验证据

（1958）MatthewMesselsonFranklinStahlMeselson和Stahl将同位素15N标记的15NH4Cl加入大肠杆菌的培养基中培养15代，使大肠杆菌的DNA都带上15N的标记，然后将该大肠杆菌转入14N的普通培养基中培养后，分离子代DNA,进行氯化铯密度梯度离心。半保留复制的实验设计DNA复制可能的三种方式以及Meselson和Stahl实验的可能结果半保留全保留弥散型15N14N0代1代半保留全保留弥散型15N14N0代1代2代Meselson和Stahl实验的实际结果二、与DNA复制有关的物质1、原料：四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)dATP,dGTP,dCTP,dTTP2、模板：亲代的两条DNA链3、引物：DNA的合成需要一段RNA链作为引物4、引物酶（Primase）：此酶以DNA为模板合成一段RNA，这段RNA作为合成DNA的引物（Primer)。实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。5、DNA聚合酶(DNAPolymerase)：以DNA为模板的DNA合成酶。以dNTP为底物;都需要Mg2+激活;反应需要有模板的指导;

反应需要有3-OH存在;DNA链的合成方向为53;DNA聚合酶的共同点：原核生物中的DNA聚合酶(大肠杆菌）DNApolIII的聚合和校对真核生物中的DNA聚合酶

（哺乳动物）DNA聚合酶α主要参与引物合成。DNA聚合酶β活性水平稳定，主要在DNA损伤的修复中起作用。DNA聚合酶γ是主要负责线粒体DNA复制的酶。DNA聚合酶ε的主要功能可能是在去掉RNA引物后把缺口补全。DNA聚合酶δ是主要负责DNA复制的酶。6、DNA连接酶(DNAligase)：

催化双链DNA切口处的3-OH和5-磷酸基生成磷酸二酯键，完成链与链之间的连接。但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来。3535OHP7、DNA拓扑异构酶(DNATopisomerase)：DNA复制过程中，使DNA螺旋结构保持松弛状态，避免产生拓扑结构，保证复制的正常进行。拓扑异构酶І：使DNA一条链发生断裂和再连接，作用是松解负超螺旋。主要集中在活性转录区，同转录有关。

拓扑异构酶Π：该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，作用是将负超螺旋引入DNA分子。同复制有关。II型DNA拓扑异构酶的作用机制I型DNA拓扑异构酶的作用机理

上海生化所1998年分子遗传学试题：拓扑异构酶8、DNA解螺旋酶/解链酶（DNAhelicase)促进DNA两条链分开的酶;可以和单链DNA结合，并且与ATP结合，通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。9、单链结合蛋白(single-strandbindingprotein,SSBP)：DNA复制过程中时，与DNA单链相结合的蛋白。其主要功能是避免单链退火形成链内氢键及保护单链不被降解。SSB与DNA结合时无序列专一性；SSB可加强DNA聚合酶对单链DNA的亲和力；与其有关复制的酶如螺旋酶作用，或促进它们发挥自身作用。链内氢键三、DNA复制的起点、方向和速度原核生物：一个复制起始位点。

例如：E.coli：oriC，全长245bp，该序列在所有细菌复制起始位点中都是保守的。

真核生物：DNA的复制是从许多起始点同时开始的。复制起点（origin）：DNA复制都是从某一特定位点开始，这一位点称为复制起点，通常用ori表示。复制子（Replicon）：从复制起点到终点，组成一个复制单位。一个复制子只含一个复制起点。所有的原核生物的染色体、噬菌体仅有一个复制子；真核生物的染色体有多个复制子，哺乳动物细胞含有50,000-100,000个，每个复制子约长50-200kb。部分生物复制子的比较复制叉（Replicationfork）：复制时，解链酶等先将DNA的一段双链解开，形成复制点，这个复制点的形状象一个叉子，故称为复制叉。复制方向和速度复制方向可以单向进行，也可双向进行，这取决于在复制起始点有一个还是两个复制叉。双向等速！无论是原核生物还是真核生物，DNA的复制主要是从固定的起始点以双向等速复制方式进行的。复制叉以DNA分子上某一特定顺序为起点，向两个方向等速生长前进。？由于DNA双螺旋的两条链是反向平行的，因此在复制叉附近解开的DNA链一条是5’→3’方向，另一条是3’→5’方向，两个模板极性不同。而所有已知DNA聚合酶的合成方向都是5’→3’，两条链无法同时进行复制。？5´3´四、半不连续复制

（Semi-discontinuousreplication）1968年，日本学者冈崎（Okazaki）等提出了DNA的半不连续复制模型。定义：DNA在复制过程中，一条链是连续合成的，而另一条链合成是不连续的，这样的复制过程称为半不连续复制。前导链(leadingstrand)：以复制叉向前移动的方向为标准，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链为前导链。后随链(laggingstrand)：与复制叉移动方向相反，随着复制叉的移动，形成许多不连续的片段，最后再连接成一条完整的DNA链，称为后随链。冈崎片段（Okazakifragment）：在DNA复制过程中，由后随链断续合成的、53的不连续的小片段称为冈崎片段。DNA的半不连续复制前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物界是有普遍性五、DNA的复制过程

（大肠杆菌为例）复制的起始1、起始复合物/引发体的形成2、RNA引物的合成3、复制体的组装新链的延伸复制的终止大肠杆菌基因组以双链环状DNA分子的形式存在，其DNA复制的中间产物可形成一个θ，复制从定点开始双向等速进行

(θ型复制)

。(一)复制起点显著特点：富含A-T

复制原点是oriC，包括245bp的序列，由9bp和13bp重复序列组成。(二)复制的起始1、起始复合物/引发体的形成①

拓扑异构酶II将负超螺旋引入DNA分子，解开超螺旋。②大约20个起始蛋白DnaA在ATP的作用下与oriC处的4个9bp保守序列相结合，形成起始复合物。促进DNA解旋或者使临近的DNA发生扭曲，使DNA解链酶进入。帮助其他与复制叉组装的相关因子进入。③在类组蛋白（HU）和ATP参与下,DanA蛋白使3个13bp直接重复序列变性，形成开链复合物。④借助于水解ATP产生的能量和在DnaC的帮助下，解链酶DnaB六体分别与两条单链DNA相结合，进一步解开DNA双链。⑤

SSB蛋白四聚体结合到单链上，形成预引发复合物/预引发体。

⑥引物酶DnaG加入形成引发体。2、RNA引物的合成DnaB蛋白活化引物酶DnaG，引发RNA引物的合成。引物长度：10nt左右。2002年上海生化与细胞所基因组DNA复制时，先导链的引物是DNA，后随链的引物是RNA()3、复制体的组装DNA聚合酶III组装到引发的DNA上完成复制体的组装。起始复合物开链复合物预引发体引发体复制体(三)新链的延伸DNA聚合酶III把新链的第一个核苷酸加到引物的3´-OH上，开始新链的延伸过程。1、前导链的合成①首先引物酶合成约10核苷酸大小的新引物。②DNApolymeraseIII以5´-3´方向延伸该新的引物。2、后随链的合成（冈崎片段的合成）(b)首先引物酶合成约10核苷酸大小的新引物。两个引物间的距离在细菌中约为1000-2000个核苷酸，在真核细胞中约为100-200个核苷酸。(c)DNApolymeraseIII以5´-3´方向延伸该新的引物，直到遇到邻接引物的5´端。这个新合成的DNA片断就是Okazakifragment。(d)

DNApolymeraseI去除引物。(e)

DNA连接酶连接相邻的冈崎片断。整个滞后链的合成重复步骤(b)到(e)。3、冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切口的连接①

DNApolymeraseI具有5´-3´外切酶的活性。在DNA聚合酶Ⅰ催化下切除RNA引物。②DNApolymeraseI具有5´-3´聚合酶的活性。留下的空隙由DNA聚合酶Ⅰ催化合成一段DNA填补上。③在DNA连接酶作用下，连接相邻的DNA链。4、协同复制机理

DNA聚合酶Ⅲ全酶的两个催化核心分别与DNA的一条模板链结合。当全酶随着复制叉沿前导链的合成方向移动时，后随链的模板被甩出来，产生一个环。随着复制叉的前进，这一环不断扩大并向复制叉前进的方向回折，造成局部冈崎片段的合成相方向与前导链合成方向一致。这样既保证了两条链合成方向都是5′-3′，又保证了后随链聚合酶移动方向能够与复制叉移动的方向保持一致。E.Coli中DNA复制的延伸(四)复制的终止当复制叉前移，遇到20bp重复性终止子序列（Ter）时，Ter-Tus复合物能阻挡复制叉的继续前移，等到相反方向的复制叉到达后在DNA拓扑异构酶IV的作用下使复制叉解体，释放子链DNA。1、链的终止需要Tus蛋白参与链的终止（Termination）E.coliDNA复制终止区的结构2、子代DNA的分离在DNA拓扑异构酶IV的作用下使复制叉解体，释放子链DNA。六、DNA复制的其他方式复制的几种主要方式线性DNA双链的复制环状DNA双链的复制θ型滚环型(rollingcircle)D-环型(D-loop)1、环状DNA双链的复制-θ型细菌环状染色体的双向复制：两个复制叉从起点开始以相反方向沿着染色体移动，在起点对面的中间点相遇并停止复制。如：ΦΧ174的双链环状DNA复制型（RF）2、滚环型(rollingcircle)正链合成不需RNA引物，在正链3´-OH上延伸。是一个连续的合成过程。复制起始于某一条DNA链上新生DNA链延伸，不断取代母链复制一圈，产生单位长度的线性DNA链若复制继续进行，可产生多单元线性DNA链正链的合成：Rollingcirclesproducemultimersofareplicon负链的合成：（1）单向复制的特殊方式；（2）模板链和新合成的链分开;（3）只有一个复制叉;滚环型复制的主要特点：是一个不连续的合成过程。3、D-环型(D-loop)Dloop复制方式首先在动物线粒体中被发现。一条短RNA与一条DNA互补，取代了该区域原来的互补的DNA链，使得两条链的合成高度不对称，一条链上迅速合成出互补链，另一条链则为游离的单环。两条链的复制起点位置不同，且复制不同步。七、真核生物中DNA的复制特点1、真核生物染色体有多个复制起点，称为自主复制序列（autonomouslyreplicatingsequences,ARS）或复制基因(replicator)；呈双向复制，多复制子。长约150bp左右，包括数个复制起始必需的保守区。3、真核生物DNA复制速度比原核慢，速度约为

50bp/s(仅为原核生物的1/20~1/50）。2、冈崎片段比原核短，长约200bp(仅为原核生物的1/10）。4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制。快速生长时，往往采用更多的复制起点；而在快速生长的原核生物染色体DNA复制中，起点可以连续发动复制。5、真核生物有多种DNA聚合酶（已知15种）。基本性质与原核相同，但一般都不具有5´-3´的外切酶活性。6、冈崎片段RNA引物的切除。RNaseH1和FEN1蛋白（5´-3´的外切酶活性）切除RNA引物，DNA聚合酶ε填补缺口，DNA连接酶进行连接反应。7、真核生物存在末端复制问题(End-replicationproblem)。DNA复制都需RNA引物的参与，其势必占据滞后链末端的一段DNA序列而使之无法复制，这意味着在滞后链末端的一段DNA序列最终未被复制。这也就是所谓的末端复制问题（End-replicationproblem）。End-replicationproblem染色体末端结构与端粒酶端粒（Telomere）：真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。生物学功能:维持染色体的稳定性维持DNA复制的完整性端粒酶（Telomerase）：是一种RNA-蛋白质复合物。其RNA序列常可与端粒区的重复序列互补；蛋白质部分具有逆转录酶活性，因此能以其自身携带的RNA为模板逆转录合成端粒DNA。结构特点：富含G的短序列多次重复，重复可多达数十甚至上百次。Themechanismoftelomereextensionbytelomerase(b)端粒酶以自身的RNA为模板，在3´端合成DNA序列。(c)端粒酶完成一轮复制，发生移位，进行下一轮复制。(a)端粒酶中的RNA序列与端粒区的重复序列互补配对。ThemechanismoftelomereReplicationToextendthelengthofatelomere,thetelomerasefirstextendsitslongerstrand.Then,usingthesamemechanismassynthesizingthelaggingstrand,theshorterstrandisextended.8、真核生物复制过程中的核小体结构（1）组蛋白的合成在细胞核中与DNA复制同步进行；（2）组蛋白八聚体以全保留方式传给子代，即亲代八聚体全部分布在子代一条链上，另一条链八聚体为新合成的。原核生物和真核生物DNA复制的比较相同点：1.Semi-conservativereplication2.Semi-discontinuousrepliction3.DNAhelicase,SSB4.RNApriming5.校正阅读（Proofreading）不同点：1.复制起点（单、多）2.复制子（大小、多少）3.复制周期的重叠与否4.复制速度(900/50nt/s)5.冈崎片段的大小6.端粒和端粒酶DNA聚合酶Polymerases核小体第二节

DNA的损伤与修复(DNAMutation&Repair)一、DNA的损伤（DNAMutation）1、DNA损伤的概念生物体生命过程中，由自发的或环境的因素引起DNA双螺旋结构发生的任何改变，都称之为DNA损伤。2、DNA损伤的因素自发性损伤

DNA复制中的损伤DNA的自发性化学变化（碱基互变异构、自发脱氨基、脱嘌呤和脱嘧啶）细胞的代谢产物对DNA的损伤（氧化损伤）物理因素引起的DNA损伤(电离辐射、紫外线)化学因素引起的损伤（烷化剂、碱基类似物）3、DNA损伤的主要类型碱基脱落、碱基（或核苷）改变、错误碱基（碱基的取代）、碱基的插入或缺失、链的断裂、链交联（链内、链间）、嘧啶二聚体等等。由于染色体DNA在生命过程中占有至高无上的地位，DNA复制的准确性以及DNA日常保养中的损伤修复就有着特别重要的意义。二、DNA的修复（DNARepair）DNA修复（DNArepair）是细胞对DNA受损伤后的一种反应。这种反应可能使DNA结构恢复原样，重新能执行它原来的功能；但有时并非能完全消除DNA的损伤，只是使细胞能够耐受这DNA的损伤而能继续生存。对DNA的修复机理进行了深入研究，发现在生物体内存在多种修复途径，如能纠正复制错误的错配修复系统，以及能修复环境因素和体内化学物质造成DNA分子损伤的直接修复系统、切除修复系统、重组修复系统和SOS修复系统等。DNA分子的双螺旋结构是其损伤修复的重要基础，因为DNA的互补双链可保证其一股链上的损伤被切除后，能从另一股链上获得修复所需要的信息。大肠杆菌中DNA的修复系统1、错配修复（mismatchrepair）

纠正复制错误的修复体系；按照“保证母链，修正子链”的原则进行修复；识别的依据是DNA双链的甲基化状态；

Dam甲基化酶：对DNA模板链的5´-GATC序列中腺嘌呤的N6位置进行甲基化修饰。当复制完成后，在短暂的时间内（几秒或几分钟），只有模板链是甲基化的，而新合成的子链是非甲基化的。对存在于GATC序列附近的复制错配按亲代链的信息进行修复错配修复系统主要包括mutH、mutL、nutS基因的产物。错配修复机理mutL,mutS和mutH识别错配碱基在未甲基化的新生子代链上产生切口在DNA聚合酶和连接酶的作用下合成新的子链片段新合成链也将在Dam甲基化酶作用下被甲基

化，从而成为全甲基化DNA2、切除修复（ExcisionRepair）当DNA的两条链中有一条受损伤，可将损伤部分切除，根据互补链的序列对其进行修复。切除修复是修复DNA损伤最为普遍的方式，对多种DNA损伤包括碱基脱落形成的无碱基位点、嘧啶二聚体、碱基烷基化、单链断裂等都能起修复作用。①核苷酸切除修复

(Nucleotide-ExcisionRepair,NER)当DNA一条链上的核苷酸发生损伤，导致相应位置双链之间无法形成氢键，则由核苷酸切除修复系统负责修复。NER的关键特征是对损伤的DNA链两端进行切割，修复补丁的大小在真核生物为25-30nt，原核生物如大肠杆菌为12nt。DNARepairbynucleotideexcision损伤发生后，首先由DNA切割酶在已损伤的核苷酸5´和3´位分别切开磷酸糖苷键，产生并移去DNA小片段，然后由DNA聚合酶合成新片段，并由DNA连接酶完成修复中的最后步骤。②碱基切除修复

(Base-ExcisionRepair,BER)BER可以去除因脱氨基、脱嘌呤、脱嘧啶或碱基丢失等因素产生的DNA损伤。

DNA糖基化酶（gylcosylases）

水解受损碱基和脱氧核糖-磷酸盐链间的N-糖苷键，从而将非正常碱基从脱氧核糖上切除。去碱基后的核苷酸被称为去嘌呤或（apurinic）去嘧啶（apyrimidinic）位点，统称为AP位点。DNArepairbybaseexcisionDNA分子中一旦产生了AP位点，内切酶就会移去AP位点附近的一小段DNA，并由DNA聚合酶和DNA连接酶共