液相色谱分析课件

现代检测技术

液相色谱分析技术高效液相色谱技术离子色谱技术色谱法的历史20世纪初色谱法诞生20世纪40年代建立了色谱基础理论20世纪50年代生产第一台商品气相色谱仪20世纪60年代高效液相色谱20世纪70年代离子色谱诞生20世纪80年代毛细管电泳色谱高效液相色谱法分类

液固吸附色谱法

吸附解吸液液分配色谱法溶解挥发

—化学键合相色谱法离子色谱法

离子交换能力凝胶色谱法以分子尺寸的差异进行分离

—凝胶过滤色谱

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凝胶渗透色谱亲和色谱法亲合力（用于细胞内容物，培养基或血浆中的纯化核酸、蛋白，抗体的分离，温度4度吸附，25度洗脱）化学键合相色谱法

键合相色谱法可分为正相色谱法和反相色谱法。正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。

官能团为－CN氰基、－NH2氨基等。流动相强度：正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。官能团为烷烃如：C18(ODS)、C8、C4用的最多，约占60～70％。流动相强度：H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃色谱柱固定相的影响色谱柱粒径的影响溶剂选择及梯度设置WaterMethanolEthanolIsopropanolAcetonitrileTHFHexaneIsooctaneN-PentaneElutionstrengthincreasesforreversedphase100%ACN90%ACN/10%H2O80%ACN/20%H2O凝胶过滤色谱法（GFC）

-尺寸排阻色谱

应用于水溶液中多肽、蛋白质、多糖的分析，测定分子量的分布。适用于对未知样品的分析，可以很快提供样品分子量大小组成的全面概况，迅速判断样品是简单的还是复杂的混合物，常常是对复杂的未知样品进行分析的关键一步。全渗透排斥选择渗透V0

VcVM空间排阻色谱被广泛应用于大分子的分级，或用来分析大分子物质的相对分子量分布。空间排阻色谱的特点：保留时间是分子尺寸大小的函数。保留时间短，谱峰窄，易检测。固定相与分子间作用力弱，柱寿命长。不能分辨分子大小相近的化合物。高效液相色谱仪高压输液系统进样系统分离系统检测系统记录系统WATERS公司HPLC仪WATERS公司HPLC仪

日本岛津公司高效液相色谱仪LC－10A

Waters高效液相色谱和超高效液相色谱液相色谱—流动相单一溶剂：甲醇、乙腈、四氢呋喃、MTBE等或水。混合溶剂：2种以上混合溶剂，如甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸缓冲溶液、己烷-乙酸乙酯等。等强度洗脱：流动相组成和流量保持恒定。液相色谱—流动相梯度洗脱：流动相组成比列和流量随时间变化。需要比例阀、阀驱动器、溶剂比例控制器、梯度程序器。注意：1、溶剂需要带盖密封；2、溶剂需要脱气处理：搅拌下真空抽气或通入惰性气体（氦、氮）驱走其中的溶解气体。液相色谱—高压泵

有往复泵、注射泵、气体放大泵等，不锈钢材质，主要是要能克服大阻力以恒定流速输送流动相。最大输出压力为：30000～50000kPa输出流量有较大调节范围：分析型0.1~10mL/min；制备型50～100mL/min。要求输出流量精度高、稳定性高。液相色谱—高压泵

目前多用柱塞往复泵。流量不受柱阻影响，调节冲程及频率即可调节流量，死体积小，容易清洗及更换流动相，适于梯度洗脱；输液有脉冲波动，对示差折光检测器产生基线噪声而影响灵敏度。脉冲阻尼器消除输出脉冲。towastePurgevalveABCD比例阀四元梯度泵--低压混合二元梯度泵--高压混合AB液相色谱—进样阀进样阀是保证色谱分析准确度的重要部件。

六通手动进样阀：罗达因（Rheodyne）进样阀：两个位置，一是取样，二是进样。有固定体积的进样定量环管，0.5-100ul之间，可根据样品情况更换选用。

自动进样器：模拟手动进样过程。

注意：1、进样阀内部通道很细，不能带有固体颗粒，所以水样需要用滤膜过滤(0.45umor0.2um)；2、样品浓度不能太高，以免在进样阀内析出结晶；3、经常清洗进样阀通道。

液相色谱—进样阀自动进样器液相色谱—自动进样样品架不锈钢材质、有柱管、接头和过滤片，柱管内填充几微米的小颗粒填料即固定相（当前仍以硅胶基质的填料占主导地位）。内径通常4-8mm、也有1-2mm的细管径分析柱，还有1mm以下的毛细管分析柱。液相色谱—色谱柱

液相色谱—色谱柱

紫外检测器-紫外吸收检测器是一种选择性浓度型检测器，仅对在紫外波长下有吸收的物质响应.灵敏度高、噪生低，应用广（70%）示差折光检测器-是一种通用性检测器，只要组分折光率与流动相折光率不同，就能进行检测检测的化合物范围广，特别在尺寸排阻色谱中多用灵敏度低，折光率随环境温度变化大，不能用于梯度洗脱荧光检测器－是最灵敏的高效液相色谱检测器，属于选择性浓度型检测器灵敏度比紫外吸收检测器高约2个数量级，特别适合于痕量分析非荧光物质可通过荧光试剂反应变成荧光物质后检测，扩大了检测器应用范围二极管阵列一种光学多通道检测器。在晶体硅上紧密排列一系列光电二极管，每一个二极管相当于一个单色器的出口狭缝，二极管越多分辨率越高，一般是一个二极管对应接受光谱上一个纳米谱带宽的单色光。高效液相色谱仪的检测器高效液相色谱法的应用生物工程中——氨基酸、蛋白质、多肽、核苷酸、核酸医药研究中——解热镇痛类药物、磺胺类药、抗菌素类合成药物的纯化质量控制、中草药的分析分离制备提纯、手性药物的分离分析，约80％的药物可以用HPLC进行分析分离。食品分析中——食品本身营养成分如糖类、有机酸、维生素、蛋白质、脂肪，食品添加剂如防腐剂、抗氧化剂、合成色素、甜味剂、保鲜化学物质，食品污染物如农药残留、黄曲霉素的分析。环境工程中——多环芳烃、农药残留、酚类、胺类、阴离子和非离子表面活性剂。精细化工——脂肪族或芳香族的醇、醛、酮、醚、酸、酯、表面活性剂、聚合物、药物、染料、炸药等化工产品

离子色谱技术离子色谱法作为高效液相色谱的一个分支，在无机阴离子分析方面占有很大优势。离子色谱的分类离子交换色谱(HPIC)－离子交换离子排斥色谱(HPICE)－离子排斥离子对色谱(MPIC)－吸附和离子对的形成柱填料多为苯乙烯－二乙烯基苯的共聚物固定相是离子交换树脂离子交换树脂又分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。用于有机无机阴离子分离的阴离子交换树脂的功能基为季胺基用于阳离子分离的阳离子交换树脂的功能基为磺酸基和羧酸基。离子交换色谱抑制电导的基本原理离子排斥色谱分离机理包括Donnan排斥，空间排阻、吸附固定相为高容量的总体磺化的苯乙烯－二乙烯基苯的共聚物用于有机酸、无机弱酸和醇类的分离强酸不被保留离子对色谱固定相是弱极性和高比表面积的中性多孔聚苯乙烯二乙烯基苯树脂和弱极性的辛烷或十八烷基键合的硅胶。流动相是在去离子水中添加有机改进剂和离子对试剂（烷基磺酸、季胺化合物）用于分析阴阳离子表面活性剂、无机阴离子离子色谱的优点离子色谱法是进行离子测定的快速、灵敏、选择性好的方法，它可以同时检测多种离子，样品处理简单，分离柱稳定性好，废液无污染或少污染.

对阴离子的测定更是其他方法所不能相比的。如果说高频感应等离子光谱是同时测定多种元素的快速、准确的分析方法，那么，同时测定多种阴离子的快速、灵敏的方法便是离子色谱法了。