T-HSPP 0005-2022 茄科植物携带柑橘裂皮类病毒检测技术规程

T/HSPP0005—2022 前 言..........................................................................................................................................................II1

范围.............................................................................................................................................................. -

1

-2

规范性引用文件.......................................................................................................................................... -

1

-3

术语和定义.................................................................................................................................................. -

1

-4

柑橘裂皮类病毒分类信息.......................................................................................................................... -

1

-5

仪器和试剂.................................................................................................................................................. -

1

-仪器设备........................................................................................................................................... -

1

-主要试剂........................................................................................................................................... -

1

-6

检测流程图.................................................................................................................................................. -

1

-7

检测方法...................................................................................................................................................... -

1

-样品制备........................................................................................................................................... -

2

-7.1.1

种子类............................................................................................................................................. -

2

-7.1.2

种苗类............................................................................................................................................. -

2

-

提取.......................................................................................................................................... -

2

-

..................................................................................................................................... -

2

-分子杂交........................................................................................................................................... -

2

-结果判定........................................................................................................................................... -

3

-8

留样保存与结果记录.................................................................................................................................. -

3

-留样保存........................................................................................................................................... -

3

-结果记录........................................................................................................................................... -

3

-................................................................................................................................................... -

3

-附 录 A（参考性附录）柑橘裂皮类病毒基本信息...............................................................................-

4

-附 录 B（参考性附录）核酸提取方法...................................................................................................-

5

-附 录 C（参考性附录）分子杂交方法...................................................................................................-

6

-附 录 D（规范性性附录）柑橘裂皮类病毒检测流程图.......................................................................-

8

-T/HSPP0005—20221 范围本文件规定了柑橘裂皮类病毒的检测技术规程。本文件适用于番茄、辣椒、马铃薯等茄科植物种子及种苗中柑橘裂皮类病毒的检测和鉴定。2 规范性引用文件文件。GB/T

6682

分析实验室用水规格和试验方法SN/T

2964

植物病毒检测规范3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4 柑橘裂皮类病毒分类信息中文名：柑橘裂皮类病毒学名：Citrus

类病毒名及缩写：

，CEVdPospiviroidaePospiviroid）。柑橘裂皮类病毒的基本信息参见附录A。5 仪器和试剂仪器设备0.001g冻离心机、台式小型离心机、恒温加热器、生物安全柜、制冰机、普通PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、2.5μL，10μL、20μL，200，1000

）、常规冰箱、超低温冰箱等。主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T

6682中一级水的规格。商品化TrizolDNAPCR缓冲液、引物和探针、乙酸电泳缓冲液，硝酸银溶液等。核酸提取相关试剂符合附录B的要求；分子杂交试剂应符合附录C的要求。6检测流程图柑橘裂皮类病毒检测流程图见附录DSN/T2964中的规定执行。7 检测方法-1-引物名称引物序列（5'-3'）产物大小（bp）CEVd371F371CEVd371RGGAAACCTGGAGGAAGTCGT/HSPP0005—2022样品制备7.1.1

种子类每份送检样本中选取100~200粒种子，表面消毒后，置于铺有吸水纸的白瓷盘或培养皿中，20℃~25℃、12

h/12

h光暗交替条件下保湿培养直至萌发。随机抽取叶片1

g~5

g，置于去RNA酶的研钵中，加入液氮后迅速研磨成细粉状，制成检测样品。7.1.2

种苗类g~200

g叶片置于去酶的研钵中，加入液氮后迅速研磨成细粉状，制成检测样品。RNA

取制备好的检测样品100Trizol法提进行总RNACEVd的茄科植物样本作为阳性对照，以无CEVd茄科植物样本作为阴性对照，同时进行提取。具体操作步骤参见附录B。核酸提取也可选择相应商业化试剂盒。RT-PCR

7.3.1 cDNA

合成0.2

mL

PCR管中加入DEPC处理去离子水10

μL、模板RNA

3

μL（50

ng~200

ng），随机引物1

，95℃735×反转录缓冲液4、10dNTPs、U/μLRNAase）0.5、200U/μL

M-MLV），混匀后37℃水浴1h转录结束后瞬时离心，95℃（或沸水）水浴5

，冰浴3

，直接进行PCR扩增。cDNA合成也可采用相应商业化试剂盒。7.3.2 PCR

反应体系：0.2mLPCR管中加入10×PCRbufferMg）2.5µL，dNTPs（10）2µL（均为10μ）各μL（见表1），5U/µL酶0.5µL，模板cDNA3μL，加DEPC处理水至总体积25

。每个样品设置两个平行反应，以双蒸水代替模板作为空白对照。表

1

反应特异性引物及序列反应程序：95℃

5

；℃

30

s，56℃

30

s，72℃

s，35个循环；72℃表

1

反应特异性引物及序列也可采用一步法RT-PCR商业化试剂盒，反应体系和反应条件可根据说明书进行适当调整。7.3.3 琼脂糖凝胶电泳检测制备1.5%1加样缓冲液与5µLRT-PCR反应产物混匀进行点样，采用后，凝胶成像检测扩增产物。7.3.4 测序分析（可选）对RT-PCRGenBank数据库中已知的CEVd序列进行相似性比对分析，验证样品检测结果。分子杂交采用RocheCEVd-20℃33的尼龙膜在杂交炉上68℃进行预杂交1h2μLRNA探针杂交10h化学发光法进行杂交检测。具体操作步骤参见附录C。-2-T/HSPP0005—2022结果判定对照成立的前提下，检测结果按照以下原则进行判定：——RT-PCR和分子杂交两种检测方法均为阳性，可判定样品中携带有柑橘裂皮类病毒；——样品RT-PCR检测或分子杂交检测结果为阳性，经测序分析验证与已知的CEVd序列相似性达90%以上，可判断样品携带柑橘裂皮类病毒；——RT-PCR和分子杂交两种检测方法均为阴性，可判定样品未携带柑橘裂皮类病毒。8 留样保存与结果记录留样保存7.1剩余制样于℃6个月。保存期满后，应经高压灭菌后方可处理。结果记录RT-PCR检测结果电泳照片、分子杂交检测结果照片、测序报告和序列分析结果图应一并保存。建档员签字等。-3-

附

录 A（资料性附录）柑橘裂皮类病毒基本信息A.1 寄主范围芸香科（）、马铃薯（

）、番茄（Solanum

lycopersicum）、melongena×hybrid）、蚕豆（fabaDaucusPetunia（Gynura）、柑橘属（Citrus）、香橼（Citrus

medica）等。A.2地理分布目前已报道发现CEVd的国家有澳大利亚、斐济、汤加、新西兰、非洲南部、俄罗斯、伯、泰国、以色列、印度、越南、中国等。A.3传播途径通过嫁接、花粉、种子和刀具机械传播。远距离通过种苗调运传播。A.4病害症状主要由于田间存在不同的CEVd株系。CEVd的株系是根据在不同的砧木/接穗的柑橘上的症状严重程来划分的，弱毒株系存在于叶片中，引起矮化症状，而强毒株系则引起裂皮症状。A.5 CEVd基因组特征CEVd基因组为单链环状分子，基因组大小约

nt，GC含量高，分子内部碱基配对形成稳定的杆状或拟杆状二级结构，在一定条件下可形成发夹状变形结构。CEVd基因组包含5个功能区：左末端区(TL)、致病区(P)、中央保守区(C)、可变区和右末端区。-4-附

录 B（资料性附录）核酸提取方法B.1

核酸提取相关试剂DEPC处理超纯水：取制备好的去离子水

mL，加入500

μLDEPC摇床震荡过夜，高温高压灭菌后室温保存；1

（pH

8.0）：称取

g

，加50

mLDEPC处理超纯水溶解，用浓HCl调8.0，定容至

mL，高温高压灭菌后室温保存；0.5

（

8.0）：称取18.61

g

NaO80

处理超纯水溶解，用约2

g

NaOH调

值至，加DEPC

100

μL，定容至100

，摇床震荡过夜，高温高压灭菌后室温保存；10×TE

（）：取1

（

）

mL和0.5

（pH8.0）

2

mL，加

mLDEPC处理超纯水溶解，定容至100

mL，高温高压灭菌后室温保存。B.2

核酸提取称取制备的检测样品

mg，转入已灭菌的去酶离心管；立即加入1

，涡旋振荡15

s，室温静置15

μL氯仿，上下颠倒混匀，室温静置2

，4℃

12000

15

；取上清于新的离心管中，加无加入等体积的异丙醇沉淀，轻微颠倒，沉降；

离心15

；弃上清，沉淀中加1

mL

预冷的75

%酒精，上下颠倒1012000

5

20

s，吸去多余液体，室温干燥5-10，加30

μLDEPC处理的去离子水溶解，-80

℃冰箱保存备用。也可选择市售商品化提取试剂盒进行核酸提取。-5-附

录 C（参考性附录）分子杂交方法C.1试剂与材料C.1.1核酸杂交相关试剂20×SSC

175.3g，88.2g

柠檬酸钠O

800mL

HCl调

，最后用定容至

1

L，高温高压灭菌后室温保存；

溶液：称取

1

g

Ficoll

，1

g

PVP-40，1

g

BSA，溶解于

80

mL

去离子水，定容至

100

，过滤除菌及杂质后-20

℃贮存；预杂交液：6×、5×Denhardt

溶液、50%(w/v)、0.5%(w/v)、μg/mL鲑鱼精

DNA（用前加热变性后加入）；杂交液：预杂交液中加入

DIG-RNA

探针，稀释成适当浓度；封闭液：将

0.73

g

NaCl，

g

NaHPO，

g

NaHPO，5

g

SDS

80

水中，定容至

100

，过滤除菌后室温保存；洗涤液

I

1/10

稀释的封闭液；洗涤液

II：将

0.24

g

，

g

NaCl，0.4

g

MgCl

水中，用

HCl

调pH

至

9.5，定容至

200

，过滤除菌后室温保存；:MOPS

）

MOPS(pH7.0)、50NaAc、；:Maleic

acid

缓冲液：100

Maleic

a