最后革兰染色法

微生物学实验医学微生物教研室姓名：余春芳新浪微博：微生物-轻舞飞扬QQ邮箱：623358585@平时成绩8分操作考试成绩12分说明：旷课：一次扣2分，四次旷课总成绩不及格；作业：教师评分C以下一次扣0.5分；微生物学试验课成绩计算微生物实验课注意事项禁止不穿白大衣进入实验室；禁止在实验室内吃东西、吸烟；不得高声喧哗，随处走动；严禁用酒精灯点燃酒精灯；严禁把实验室内任何物品带出室外；病原材料污染桌面、地板等或误吸入口，应立即报告教师进行处理；爱护实验仪器设备，损坏仪器要赔偿；实验完毕，废弃物放入指定地点，桌面理清洁，洗手后方可离室。值日同学负责打扫实验室，并关好水电、门窗方可离开。

实验一革兰染色法

了解细菌涂片制作掌握革兰染色法的原理、方法以及意义掌握油镜的使用实验目的要求细菌形态检查方法染色标本的检查

常用方法：革兰染色法、抗酸染色法、特殊结构染色法

应用：观察细菌大小、形态、排列、染色性、特殊结构，鉴别细菌不染色标本检查

常用方法：压滴法、悬滴法、暗视野映光法(P5)应用：主要用于观察活菌的动力和运动方式细菌染色的方法单染法:采用一种染料染色,只能观察细菌的形态和排列特征，不能观察细菌的染色特性和进行鉴别。复染法（鉴别染色）:采用两种或两种以上的不同染料进行先后染色，使不同种类的细菌、同种细菌的不同结构，分别染上不同的颜色，以便鉴别细菌。革兰染色法该染色法是用于细菌分类、鉴别最常用最重要的染色法。是丹麦细菌学家革兰于1884年创建的,至今仍广泛应用。革兰氏细菌的细胞壁结构革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的的细胞壁差异革兰染色法的原理★渗透学说：与肽聚糖的结构有关

革兰阳性菌细胞壁主要由致密的肽聚糖网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，酒精不易渗透，反而可使细胞壁脱水而形成一道屏障，阻止染料向细胞外渗。革兰阴性菌细胞壁肽聚糖层较薄、交联度低，脂类含量高，酒精易渗透进入细胞内，将结合的结晶紫碘复合物脱出。★化学学说：与细菌细胞质中核糖核酸镁盐有关

革兰阳性菌细胞质中的核糖核酸镁盐与结晶紫-碘结合形成更大的复合物，不易被酒精脱出。★等电点学说：与细菌所带电荷有关

革兰阳性菌等电点低（pI）为2~3，在中性或碱性环境中所带负电荷多；革兰阴性菌pI为4~5，所带负电荷少，影响结合染色的多少实验材料与方法材料:

菌种：葡萄球菌和大肠埃希菌混合物（18-24h）

牙垢

试剂：结晶紫染液、碘液

95%酒精、稀释苯酚复红液其他：玻片、接种环、酒精灯无菌生理盐水、显微镜等染色标本检查基本程序涂片干燥固定染色镜检实验步骤一、细菌涂片的制作

取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴单蒸水，按无菌操作法取菌涂片，做成浓菌液。2.再取干净载玻片一块将刚制成的浓菌液挑2-3环涂在玻片两边制成薄的涂面，注意取菌不要太多。3.将玻片反复在酒精灯上方通过几次（用手指触摸涂片反面，以不烫手为宜），对标本进行干燥、固定（也可自然干燥）。待涂片冷却后，再加染色液。涂片制作1.初染：在涂片上加结晶紫（以盖满细菌涂面为宜），染色 约1分钟后水洗。2.媒染：滴加碘液染色1分钟，水洗。3.脱色：把玻片上的水吸净，用95%酒精滴洗玻片，直到滴出 的酒精刚好不出现紫色，大约30秒钟，立即用水洗。4.复染：滴加稀释苯酚复红染液染色30秒钟，水洗后涂片用吸水纸吸干或者放空气中晾干。二、革兰氏染色AProceduresofGramStaining初染媒染脱色复染结晶紫1分钟碘液1分钟95%酒精30秒稀释苯酚1分钟(1)先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，找出适当的视野。(2)将高倍镜转出，然后在涂片上加香柏油一滴。(3)将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的颜色和形态。三、涂片观察P3四实验完毕后的处理：1.将浸过油的镜头按照下述方法擦拭干净：a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯（）将镜头擦2-3次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。`注意擦镜头时向一个方向擦拭。2.镜检后的染色玻片用纸将香柏油擦干净。1.涂片后要注意固定、干燥，以免标本被冲洗掉。注意事项2.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。

如果脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌。

如果脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。

脱色时间的长短受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格界定。4.选用幼龄的细菌。选用培养16h-24h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。3.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。金黄色葡萄球菌(10×40)大肠杆菌(10×40)染色结果染色结果螺形菌Spiralbacterium革兰染色意义★有助于鉴别细菌★有助于选择抗菌药物★有助于研究细菌的致病性选择抗菌药物革兰氏阳性菌：葡萄球菌属（主要是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等）、链球菌属（肺炎链球菌、草绿色链球菌、肠球菌等）、白喉杆菌、炭疽杆菌、破伤风杆菌、蜡样芽孢杆菌等，其中，金黄色葡萄球菌、肠球菌等为临床重要等病原菌革兰氏阳性菌通常对青霉素类、第一（或第二）代头孢菌素等高度敏感，青霉素可为化脓性细菌感染可首选药物。选择抗菌药物革兰氏阴性菌：沙门氏菌属、志贺氏菌属（痢疾杆菌等）、嗜血杆菌属（杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌等）、霍乱弧菌等。革兰氏阴性菌在院内感染中的细菌感染中占了大约65%，且大多菌株容易对抗菌药物耐药革兰氏阴性菌对第三代头孢菌素、氨基糖苷类、抗假单胞菌属的青霉素类、多粘菌素等高度敏感，对头霉素类和第二代头孢菌素也较敏感。例如氟哌酸对革兰染色阴性杆菌有效，如肠道病、腹泻为常用药。研究细菌的致病性革兰阳性菌可产生外毒素致病。革兰阴性菌主要以内毒素致病。（LPS作为G-菌内毒素致病）实验思考1.为什么革兰氏染色后细菌会分出两种颜色？2.革兰氏染色最关键的是哪一步，此时阳性菌和阴性菌各应该是哪种颜色，不经过复染这一步能不能区别革兰氏阳性菌和阴性菌？3.固定的目的之一是杀死细菌，这与用自然死亡的菌体进行染色有什么不同?实验步骤观看鞭毛、荚膜、芽孢的示范片绘图、写实验报告细菌的特殊形态结构观察

细菌的特殊结构芽胞(nuclearmater