第5章 离子交换层析

第五章离子交换层析（Ionexchangechromatography）2/4/2023海南大学农学院wss1离子交换层析的概念离子交换层析是利用分离物（蛋白质）表面的荷电的离子或基团与带相反电荷的不溶性基质（离子交换剂）进行可逆的交换。更确切地，是先用蛋白质偶极离子置换基质官能团上的平衡离子（反离子），然后蛋白质本身又随着平衡离子的比例的增加而被置换下来。根据蛋白质各组分所带电荷的性质及电荷量的差异，被置换的速度不同而在层析过程中达到分离。2/4/20232内容提要第一节 基本原理第二节 离子交换剂的分类与性质第三节操作第四节应用2/4/20233第一节 基本原理1.离子交换剂2.交换反应3.原理4.离子交换剂与离子结合的关系5.两性电解质与离子交换剂的结合力2/4/20234离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。2/4/20235

纤维素－O－CH2－COO一—Na+

基质电荷基团反离子

羧甲基纤维素离子交换剂组成示意图1.离子交换剂（1）离子交换剂：即是通过化学键合的方法向惰性支持物上连接可解离的化学基团后的产物。由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。2/4/20236阴离子交换剂与阳离子交换剂的基本构成：

基质－电荷基团－反离子（反离子基团）阴离子交换剂阳离子交换剂2/4/20237RA+B+

RB+A+

RA代表阳离子交换剂，它在溶液中解离出来的阳离子A+与溶液中的阳离子B+能发生可逆的交换反应。2.交换反应2/4/20238离子交换反应：R-A++B+R-B++A+平衡常数表示离子交换剂对溶液中不同离子的亲和力：[A][B]AB[RB][RA]++K

=[A]=[B]KA

B=[RB][RA]++KAB=1[RA]＞[RB]KAB＞1[RA][RB]KAB1＜＜[RB]=[RA]2/4/20239KAB值反映离子交换剂对不同离子的亲合力或选择性的参数，称KAB值为离子交换剂对A+和B+的选择系数。2/4/2023103.离子交换层析的原理利用蛋白质及欲分离的生物分子带电性质的差异为分离依据；带电荷的蛋白质样品可以与离子交换剂的带正电荷或负电荷的基团结合；蛋白质样品同离子交换剂的结合力取决于彼此间相反电荷基团的静电吸引力，pH影响这种吸引力；蛋白质的洗脱通过改变洗脱液的盐离子强度和pH来完成。2/4/202311

大分子依其与离子交换剂亲和力的不同，而以不同牢度被吸附于离子交换剂上，通过改变离子强度或(和)pH使大分子再从离子交换剂上先后被洗脱下来。2/4/202312混合样品带负电荷，与阴离子交换剂结合。样品碱性较弱，吸附力较弱，用低浓度盐洗脱。样品碱性强，与交换剂结合牢，解脱难。用高浓度盐洗脱。各样品带电荷不同，与离子交换剂的结合能力不同。依解离的难易的差异，而达到分离。2/4/202313离子交换层析示意图2/4/2023海南大学农学院wss14Whathappensinionexchange?SampleapplicationandwashElutionEquilibrationRegeneration--------------------------------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++-----------2/4/202315Whathappensinionexchange?Equilibration++++++-------anionexchangebead2/4/202316Whathappensinionexchange?Sampleapplicationandwash-----------++++++----2/4/202317Whathappensinionexchange?Elution----------------------------------++++++++++++--2/4/202318Whathappensinionexchange?Regeneration-----------------------++++++2/4/2023194.离子交换剂与离子结合的关系强酸性离子交换剂、强碱性离子交换剂对各种反离子的结合与否以及结合力的强弱遵循一定的规律；并对样品选择离子交换剂、洗脱液离子类型、pH状态都至关重要。离子交换剂与各种水合离子的结合力是与离子的电荷量成正比，与水合离子的半径的平方成反比关系。2/4/202320离子交换剂在溶液中与水合离子结合能力的趋势结论：离子价数愈高，结合力愈大。离子间电荷相同时，离子的原子序数愈高，水合离子半径愈小，结合力愈大。故元素周期表中离子结合力的趋势的方向为：从小至大。(P71表5-1)2/4/2023215.两性电解质与离子交换剂的结合力蛋白质、酶、多肽、核苷酸及核酸等两性电解质与离子交换剂的结合力取决于其本身的物理化学性质和在特定pH条件下呈现的离子状态。当pH﹤pI,带正电荷，被阳离子交换剂吸附。pH﹥pI,带负电荷，被阴离子交换剂吸附。pI离pH愈远，分离物所带电荷越强，越容易被离子交换剂吸附，吸附力强，越难解吸附。2/4/202322内容提要第一节 基本原理第二节 离子交换剂的分类与性质第三节操作第四节应用2/4/202323第二节 离子交换剂的分类与性质离子交换剂的基本要求：1.高度的不溶性；2.多孔的结构，巨大的表面积；3.丰富的交换基团；4.稳定的物理化学性质。2/4/202324一、分类A.阳离子交换剂是在不溶性载体上,结合有中性pH下带负电荷的官能团（羧甲基或磺丙基基团）。这类树脂适合于分离等电点在中性以上的蛋白质。三角形代表负电荷的官能团，释放的反离子带正电荷。+--+++--2/4/202325阴离子交换剂带正电荷官能团，反离子带负电荷。B.阴离子交换剂的官能团（二乙氨乙基DEAE或季氨碱QAE）树脂在中性pH条件带正电荷。释放的反离子带负电荷，在中性pH时能与酸性蛋白质相互作用。+__++_2/4/202326离子交换树脂的基本类型阳离子交换剂强酸性弱酸性阴离子强碱性交换剂弱碱性交换基团磺酸基羧酸基季铵基伯、仲铵基交换离子-SO3H-COOH-NH3-NHR、-NH2工作范围（pH）1～147～140～120～7水解稳定性稳定易水解稳定易水解离子吸附速度大H型小大OH型小2/4/202327请记住：阳离子交换剂本身带酸性基团，在其pK以上荷负电。阳离子分为：强酸性、中强酸性、弱酸性阴离子交换剂本身带碱性基团，在其pK以下荷正电。阴离子分为：强碱性、中强碱性、弱碱性2/4/2023281.疏水性离子交换剂疏水性离子交换剂中的基质是人工合成的、与水结合力较小的物质，称为树脂。其基质的化学本质是苯乙烯和二乙烯苯合成呈网状的聚合体，引入不同的电荷基团。2/4/202329疏水性离子交换剂具有如下特性而被广泛应用：

大量的活性基团较高的交换容量良好的机械强度稳定的物理化学性质均匀的球形颗粒、型号齐全以及丰富的产品2/4/2023302.亲水性离子交换剂亲水性离子交换剂的基质是一类天然的或人工合成的、与水结合力较大的物质。有：纤维素Sephacel、交联葡聚糖Sephadex交联琼脂糖Sepharose2/4/2023311）纤维素Sephacel离子交换剂基本结构:以微晶纤维素为基质，化学方法引入电荷基团，构成各种阳离子、阴离子交换剂;示弱阴离子树脂的结构（DEAE-Sephacel）BeadedCellulose-O-CH2-CH2N+-H-Cl-CH2CH3CH2CH32/4/2023322/4/2023海南大学农学院wss332)交联葡聚糖Sephadex离子交换剂以交联葡聚糖G－25和G－50为基质，化学法引入电荷基团构成各种阴离子、阳离子交换剂。（DEAE-Sephadex、QAE-Sephadex）。DEAE-Sephadex-O-CH2-CH2-N+-H-Cl-QAE-Sephadex-O-CH2-CH2-N+-CH2-CH(OH)-CH3-Cl-CH2CH3CH2CH3CH2CH3CH2CH32/4/2023342/4/2023海南大学农学院wss353)琼脂糖Sepharose离子交换剂以交联琼脂糖CL-6B为基质，化学法引入电荷基团构成阳离子交换剂CM－SepharoseCL-6B和阴离子交换剂DEAE-SepharoseCL-6B。CM(SepharoseCl-6B)-O-CH2-C-02Na+DEAE-SepharoseCl-6B-O-CH2-CH2-N+-H-Cl-CH2-CH3CH2-CH32/4/202336亲水性离子交换剂的结构琼脂糖离子交换剂的基本结构以交联琼脂糖CL－6BSepharose为基质。其网孔的大小通过交联剂的比例调节，适合分离各种不同分子量的物质。2/4/202337ScanningelectronmicrographofanagarosegelMagnificationx50,000Ref: AndersS.Medin,PhDThesis,UppsalaUniversity19952/4/202338二、离子交换剂的性质1.颜色与形状2.交联度3.吸水量或膨胀度4.交换容量5.稳定性6.比重7.流速2/4/202339离子交换剂的性质1.颜色与形状2.交联度:离子交换剂的基质的交联度根据适用的要求，调节交联剂在基质中的比例或百分浓度而制成各种（筛孔）型号的交换剂。3.吸水量与膨胀度：是指离子交换剂在水溶液中吸取的体积，即筛孔中所占的体积（Vi）。吸水量与膨胀度受基质的性质、离子强度、pH、电荷基团及交联度的影响。4.交换容量：离子交换剂与溶液中离子或离子化合物进行交换的能力。2/4/202340离子交换剂的膨胀度与离子强度的关系1）在相同离子强度的条件时,膨胀度随着基质的交联度的增加而降低。2）在相同离子强度的条件时，强酸、强碱型的离子交换剂的膨胀度大，弱酸、弱碱的膨胀度小。说明前者的解离度达最大，带电荷基团之间的排斥力大，结果膨胀度亦大。2/4/202341pH对离子交换剂膨胀度的影响弱阳离子交换剂的膨胀度随着pH的增高而增大弱阴离子交换剂的膨胀度随着pH的降低而增大弱离子交换剂在其近pK值时的pH中膨胀度最小交联度大的或带强电荷基团的离子交换剂，其膨胀度基本与pH的变化无关2/4/202342离子交换剂的性质1.颜色与形状2.交联度:离子交换剂的基质的交联度根据适用的要求，调节交联剂在基质中的比例或百分浓度而制成各种（筛孔）型号的交换剂。3.吸水量与膨胀度：是指离子交换剂在水溶液中吸取的体积，即筛孔中所占的体积（Vi）。吸水量与膨胀度受基质的性质、离子强度、pH、电荷基团及交联度的影响。4.交换容量：离子交换剂与溶液中离子或离子化合物进行交换的能力。2/4/202343交换容量的影响因素筛孔：筛孔的直径与分离物的分子量大小密切相关。(表P76)离子强度：离子强度的增加引起对交换剂上结合蛋白质位点的竞争，而降低交换容量，在解离中便利用逐渐加大离子强度的原理。2/4/202344pH与交换容量的关系弱阴离子交换剂的交换容量是随着pH的下降而增大弱阳离子交换剂的交换容量是随着pH的上升而增大强阴离子与强阳离子交换剂的交换容量基本与pH变化无关，因其完全呈解离状态，始终很高2/4/202345交换容量的影响因素若加样量超过树脂的容量，宝贵的活性会随着未吸附的物料一起流失；若树脂过量，会大大减少活性物质的回收。测定实验：2/4/202346注意交换容量包含样品中的总蛋白量，而非仅仅是活性蛋白。各种蛋白样品与树脂的交换容量是不同的，应分别测定。放大实验时，应适当留一定的结合空间，并使之在最小量。2/4/202347最佳上样pH的选择pH5.05.56.06.57.09.0+SSSSSS4℃,30～60min摇匀，充分结合＋＋＋＋＋＋＋

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在低的pH时，蛋白质未结合，上清有活性，随着pH的上升，蛋白质与树脂结合愈多，直至完全结合，上清中再检测不到活性。+－离心，检测上清的活性最佳上样时高于缓冲液一个pH2/4/2023485稳定性：都具有理化稳定性。6比重：7流速：2/4/202349内容提要第一节 基本原理第二节 离子交换剂的分类与性质第三节操作第四节应用2/4/202350第三节操作一、离子交换剂的选择、处理与转型二、缓冲液的选择三、分离物质的交换四、程序2/4/202351一、离子交换剂的选择、处理与转型被分离物质带正电荷，选择阳离子交换剂；被分离物质带负电荷，选择阴离子交换剂；被分离物质为两性离子，依据其在稳定的pH范围内所带电荷选择交换剂。阴离子交换剂结合带阳离子交换剂结合带负电荷的蛋白质正电荷的蛋白质2/4/202352①对于已知pI的物质：在高于其等电点的pH，用阴离子交换剂；在低于其等电点的pH，用阳离子交换剂。②对于未知pI的物质：可参照电泳的结果，在中性或偏碱性的条件下进行电泳，向阳极移动较快的物质，在同样条件下可被阴离子交换剂吸附；向阴极移动或向阳极移动较慢的，可被阳离子交换剂吸附。2/4/202353离子交换剂的选择的原则★分离生物大分子一般采用亲水性基质。具有可人工控制的分子筛，及较多的可交换的基团；★分离酶、核酸、蛋白质等采用弱性的离子交换剂。其交换容量大，亲水性，对生物样品的稳定性好，易发生结合；★洗脱液的pH与被分离物的pI至少相差一个pH值，才能将各种成份分开。pH﹥pI一个单位时选择阴离子交换剂；pH﹤pI一个单位时选择阳离子交换剂。2/4/202354离子交换剂的选择的原则例：。pI＝5.2的物质在不同的pH条件下带电荷性质、带净电荷量不同，而能分别与阳离子、阴离子交换剂结合。实验上选择阴离子，因为从pH6.2－8.5条件温和。不影响生物样品活性；选择阳离子时，pH从4.2－3.0，条件极端，可能使样品失去活性。2/4/2023552.离子交换剂的处理、再生和转型目的：要求其带上使用时所期望的离子或基团。处理步骤：先用水浸泡至充分膨胀即可进行处理。除细颗粒酸碱浸泡水洗涤碱或酸处理水洗涤缓冲液平衡再生：通过酸碱反复处理或借助转型处理完成。转型：指离子交换剂由一种反离子转到另一种反离子的过程，转型后的离子交换剂会按使用要求带上一定种类的离子或基团。除杂质：P84表5-92/4/202356为什么金属离子(Na+、K+等)可以吸附在H-型强酸型阳离子交换柱上，而后又可以用HCl来再生强酸型阳离子交换柱?

亲和力大小不仅与离子性质有关，而且与其浓度有关。前者根据一价金属离子的亲和力顺序不难理解，而后者是采用高浓度HCl来再生强酸型阳离子交换柱。2/4/202357二、缓冲液的选择离子交换剂吸附被分离物的量与缓冲液的pH值和离子浓度有密切关系。起始缓冲液：pH值一般比有效成分的pI值高一个单位或低一个单位，离子强度为0.1。洗脱液：离子强度和pH值应使有效成分从离子交换剂上解离下来。一般离子强度要比起始缓冲液高，pH值是随着离子交换剂性质变化而变化。2/4/202358三、交换动态法---柱层析法：交换效率高，应用广泛。适合于制备、纯化及分析。适用于实验室、科研，教学以及模型的建立；静态法---可以大容器：盆、缸、桶、罐等操作。样品液与交换剂进行混合、搅拌、吸附，滤去上清液，再解吸附，浓缩。适合工厂，生产车间，产品的中试。其操作方便，设备简陋，快速定性等优势。2/4/202359四、程序填装柱子柱子平衡加入样品开始洗脱分步收集定性检测合并峰值浓缩样品除去盐离子定量分析计算回收率及纯化倍数再生2/4/202360离子交换剂层析装置（梯度洗脱配置）2/4/2023611.装柱与加样量样品的准备样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。样品的不溶物应在透析后或凝胶过滤前以离心法除去。2.洗脱原则：增加离子强度、改变pH值方式：梯度洗脱（Gradientelution）阶段洗脱(Stepwiseelution)2/4/202362

2/4/202363离子强度的线性梯度洗脱曲线p86盐浓度吸收曲线2/4/202364离子强度非线性梯度(阶梯式洗脱曲线)2/4/202365影响梯度洗脱速率变化的因素A：当CA、CB的浓度确定后，总体积V越小，梯度速率变化越快。ABB：当体积V确定时，CB－CA差值越大，梯度速率变化越快。0.50.40.30.20.10.50.40.30.20.1Vt1Vt22/4/202366比较线性梯度与阶梯式梯度洗脱显示：在样品组分、柱子规格、缓冲液成份、洗脱速度相似的条件时，其分辨率有差异。但并未表现明显优势。依据实验经验，当分离物各组分差异较小时，选用线性梯度；差异较大则选用阶梯式梯度，以减小体积和节省时间。2/4/202367A.C.相同条件的线性梯度

A.流速8毫升/小时，C为20毫升/小时；

B与A的流速相同，离子梯度不同

结果：三者显示分辨率不同的结果线性梯度、洗脱速度与分辨率2/4/202368梯度图的分析当缓冲液的pH﹥pI（样品）时，样品带负电荷，结合到阴离子交换剂，解吸附时，将pH下降，越来越靠近pI，直至其pI、甚至pH﹤pI,样品电荷由－0＋。样品解离。A为阴离子交换剂。pH从10－7.5，变化。当缓冲液的pH﹤pI（样品）时，样品带正电荷，结合到阳离子交换剂，解吸附时，将pH上升，越来越靠近pI，直至其pI、甚至pH﹥pI,样品电荷由＋0－。样品解离。B为阳离子交换剂。pH从4.5－8.9变化。AB2/4/202369内容提要第一节 基本原理第二节 离子交换剂的分类与性质第三节操作第四节应用2/4/202370去离子水的制备自来水过滤R-SO3H柱RN(CH3)3OH柱去离子水混合柱RN(CH3)3OH柱1.水处理2/4/202371交换柱的填充树脂一般采用强酸型阳离子交换树脂和强碱型阴离子交换树脂，如001×7(732#)和201×7(717#)；由于交换容量不同，实验中通常采用一根阳离子交换柱和二根阴离子交换柱。混合柱也应按等交换容量比例混合；混合柱的作用：由于离子交换是可逆反应，经过阳离子交换柱和阴离子交换柱处理的去离子水，还存在着微量未交换的离子。若让它再通过混合柱，由于两种交换过程同时进行，离子交换后生成的H+和OH‑结合成水而除去，进一步提高了水的质量。实验室精制去离子水可采用

5cm×100cm混合柱处理一次去离子水。2/4/2023722.分离纯化小分子物质

离子交换层析广泛应用于无机离子、有机酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物质的分离纯化。2/4/202373核苷酸的解离性质（pK）核苷酸磷酸基一级解离氨基磷酸基二级解离pIAMP0.93.76.22.35GMP0.72.46.11.55CMP0.84.56.32.66UMP1.0__6.4__见图P88的分离图谱2/4/2023743.分离纯化生物大分子物质

离子交换层析是依据物质的带电性质的不同来进行分离纯化的，是分离纯化蛋白质等生物大分子的一种重要手段。用离子交换层析制备、纯化电荷量不同的生命物质时，不但被分离物的活性可以保存，而且分辨率较高。2/4/202375各蛋白质样品的等电点BSApI=4.7糜蛋白酶pI=8.8胰蛋白酶pI=8.1细胞色素CpI=9.8～10.12/4/2023764.测定蛋白质的等电点pH

活力单位5678pH梯度变化，间隔0.2单位。检测每管的活力单位。确定该酶的等电点。2/4/202377pI=5.3阳离子交换剂05.05.58.0活性阴离子pH8.0－－pH6.5－－pH5.5－＋pH5.0＋pH4.5＋＋pH4.0＋＋＋不吸附，上清有活性吸附，上清无活性阳离子pH8.0－－－pH6.5－－pH5.5＋—pH5.0—pH4.5＋＋pH4.0＋＋＋不吸附，上清有活性吸附，上清无活性用阳离子时，活性出现在高pH的上清中;用阴离子时，活性出现在低pH的上清中。阴离子交换剂2/4/202378小节进行离子交换的蛋白质在实验条件下必须有单一电荷。溶液中单一电荷的蛋白质可被离子交换剂树脂上的小离子交换，固定在树脂上；通过增加溶液中反离子浓度或降低蛋白质所带电荷量等方法可将蛋白质从树脂上洗脱下来。蛋白质的等电点是离子交换剂层析的重要依据。进行离子交换层析的最佳溶液pH值一般与蛋白质的等电点相差一个单位；使蛋白质的静电荷量即可保证结合在离子交换剂上，又利于洗脱与分离。交换树脂的选择:被分离物质带正电荷，选择阳离子交换剂，被分离物质带负电荷，选择阴离子交换剂；被分离物质为两性离子，依据其在稳定的pH范围内所带电荷选择交换剂。2/4/202379树脂的溶胀（膨胀）与pH、离子强度、与交换容量的关系。