第五章色谱法-1

第五章高效液相色谱法

（HPLC）主要内容第一部分：液相色谱分离原理第二部分：液相色谱条件优化第三部分：维护及常见问题第一部分：液相色谱分离原理正相液相色谱键合相色谱氢键力流出顺序影响HPLC分离的反相条件主要内容第一部分：液相色谱分离原理第二部分：液相色谱条件优化第三部分：维护及常见问题分子量<2000Step1Step2TheUPLC–MS/MSsystemconsistedofanAcQuityTMultraperformanceliquidchromatographandaQuattroPremierMicromass®massspectrometer(Waters/Micromass,Milford,MA).AnAcQuityUPLCTMBEHC18column(1.7um,50mm×1mmi.d.)alsofromWaterswasusedfortheanalysis.Thecolumnwasmaintainedat30◦C.ThestandardsandsampleextractswerechromatographedbyUPLCwithagradientmobilephaseconsistingof0.1%formicacidinwaterassolventAandacetonitrile(ACN)assolventB.Thegradientconditionofmobilephaseis:0min85%A,1.00min70%A,and2.50–4.00min85%A.Theflowrateis0.20ml/min.残留硅羟基残留的重金属总结—分离度的改善液相色谱分析开发液相色谱分析方法分辨率是色谱分析中主要考虑的因素。在开发色谱方法时，有很多因素是很重要的。除分辨率之外，以下因素都要考虑。

1.灵敏度5.成本

2.载样量6.容易使用

3.分析速度7.色谱柱寿命

4.溶剂消耗8.效率液相色谱分析方法的建立（1）分子量：在样品预处理或GPC分析时有用；（2）选择合适的液相色谱方法（正相、反相或其他）；（3）选择合适的色谱柱；（4）溶解度：选择流动相的条件；（5）官能团：有否离子化基团？保留特性如何？（6）样品的基质：考虑是否要前处理，如何前处理；（7）选择合适的K’值的条件；（8）选择良好的峰位（a值）；（9）选择良好的色谱柱条件（N值）；（10）检测特性：是否有紫外吸收？荧光？（11）用实测样品解决出现的特殊问题；（12）证实方法的正确性。方法样品特点/色谱柱何时应用该方法反相HPLC流动相：水/有机溶剂色谱柱：C18（ODS），C8，苯基，三甲基硅烷，氰基首选为能溶于水/有机混合物的中性或非离子化合物。离子对HPLC流动相：水/有机溶剂（一种缓冲物控制pＨ和离子对试剂）色谱柱：C18（ODS），C8，氰基离子或可电离化合物，尤其是碱性或阳离子化合物的良好选择正相HPLC流动相：有机溶剂混合液色谱柱：氰基，二醇基，氨基，硅胶当反相或离子对HPLC无效时的第二个较好选择；首选为不溶于水/有机混合液的亲脂样品，异构体混合物和制备HPLC硅胶最好选择液相色谱的方法主要液相色谱方法特性方法描述/色谱柱何时应用该方法离子交换色谱法流动相：水相，另以缓冲物控制pH色谱柱：阳离子或阴离子交换分离无机离子混合物的首选（离子色谱法）；分离蛋白质、核酸样品及有关化合物的良好选择体积排阻色谱法流动相：水相（GFC）或有机相（GPC）色谱柱：GFC用二醇基，GPC用聚苯乙烯或硅胶，孔径大小支配分子量范围分离大分子样品，如蛋白质和人造聚合物的良好首选，也可用于测量分子量的分布疏水作用色谱法流动相：盐溶液色谱柱：类似于反相填料，但疏水性小得多用于分离蛋白质选择液相色谱的方法次要液相色谱方法特

性峰位的重排在分析多组分样品时，仅改变流动相的强度（组成百分比）而不改变其组成，一般仅仅改变所有组分的tR，不会发生峰位重排。在反相色谱中，下列条件改变可能发生峰位重排：（1）流动相中换了强溶剂种类；（2）pH值的改变；（3）柱填料的改变；（4）柱温的改变；（5）流动相组成的改变（如加入离子对试剂三乙基胺等）

分析方法的开发第一步干什么？想办法得到各种信息向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法；查文献，各种手册，如药典、农药手册以及国家标准；向仪器制造商询问。对色谱柱有足够的了解掌握分离机理，自己开发方法。充分了解自己的样品

分析方法的开发分析时要了解哪方面的情况？灵敏度的要求有多高？样品的本底是否很复杂？有多少组分要分析？对分析的精确度、准确度等有多高要求？是否因是日常检验而要求方法容易使用？要分离的样品量有多大？要分离的组分在样品中的含量很高还是微量？是否需要保持生物活性？对分离产物纯度的要求有多高？纯度和活性的鉴定如何完成？

分析方法的开发一般的具体步骤先用一根短的色谱柱用相对较高的流速使用尽可能纯度高的标准品先用高强度的洗脱液调节k值改变保留值调节a值改变选择性调节柱长度改变柱效及分离速度请记住每次改变一个参数等浓度洗脱系统主要内容第一部分：液相色谱分离原理第二部分：液相色谱条件优化第三部分：维护及常见问题。日常使用需注意作业在硅胶柱上，用甲苯为流动相