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文档简介

葛芹玉学习科学研究中心RNA干扰技术及其应用RNA干扰技术(RNAinterference)RNAi(RNAinterference,RNA干扰)

近年来的研究表明,将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞,可以使mRNA发生特异性的降解,导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)被称为RNA干扰(RNAi)。

RNAi相关技术是研究转录后调控的有效工具,可用于功能基因组学研究以及基因治疗等临床用途。RNA是生物体内最重要的物质基础之一,它与DNA和蛋白质一起构成生命的框架。但长久以来,RNA分子一直被认为是小角色。它从DNA那儿获得自己的顺序,然后将遗传信息转化成蛋白质。然而,一系列发现表明——这些小分子RNA事实上操纵着许多细胞功能。它可通过互补序列的结合反作用于DNA,从而关闭或调节基因的表达。甚至某些小分子RNA可以通过指导基因的开关来调控细胞的发育时钟。RNAi技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达,使细胞出现靶基因缺失的表型。近年来研究表明,将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞,可以使mRNA发生特异性降解,导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)被称之为RNA干扰(RNAi)RNA干扰技术(RNAinterference)研究发现,双链RNA是RNAi的触发物,引发与之互补的单链RNA(

ssRNA,single-strandedRNA)的降解。经过Dicer(一种具有RNAaseIII活性的核酸酶)的加工,细胞中较长的双链RNA(30个核苷酸以上)首先被降解形成21~25个核苷酸的小分子干扰核糖核酸(siRNA,shortinterferingRNA),并有效地定位目标mRNA。siRNA是引发转录后基因沉默中序列特异性RNA降解的重要中间媒介,它具有特殊的结构特征,即5’端磷酸基团和3’端的羟基,其两条链的3’端各有两个碱基突出于末端。由siRNA中的反义链参与指导合成被称为RNA诱导的沉默复合体(RISC)的核蛋白体,再由RISC介导切割目的mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域,从而实现干扰靶基因表达的功能。

双链RNA(dsRNA)对基因表达的阻断作用被称为RNA干扰(RNAinterference,RNAi)。

双链RNA(dsRNA)经酶切后会形成很多小片段,siRNA和miRNA。

siRNA一旦与信使RNA(mRNA)中的同源序列互补结合,会导致mRNA失去功能,即不能翻译产生蛋白质,也就是使基因“沉默”了。1990年,为加深矮牵牛花(petunias)的紫色,Jorgensen等导入了一个强启动子控制的色素基因。可是结果与预期相反,许多花瓣颜色并未加深,反而呈杂色甚至白色。这是由于转基因和同源的内源基因的表达都被抑制了,Jorgensen把这个现象命名为共抑制(cosuppression)1、RNA干扰现象的发现1990年RichJorgensen在矮牵牛花中发现转基因沉默。1998年,Fire发现线虫的RNA干扰现象。mex-3RNAAcontrol:notstainedB:wtC:wt+antisenseRNAD:wt+dsRNA1995年,康奈尔大学的SuGuo博士用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现,反义RNA(antisenseRNA和正义RNA(senseRNA)都阻断了基因的表达,他们对这个结果百思不得其解。直到1998年,AndrewFire的研究证明,在正义RNA阻断了基因表达的试验中,真正起作用的是双链RNA。这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的。于是提出了RNAi这个词。2002年,Zernicka-Coetz等用双链RNA注射小鼠受精卵和着床前的胚胎,结果发现导入的双链RNA可以特异性的抑制C-mos,E-cadherin和GFP基因的表达。JudyLieberman和PremlataShankar首先向公众宣布了在动物中利用RNAi技术治疗疾病的研究进展。同样在2002年,科学家研究了酵母和四膜虫两种生物体的RNAi现象,他们发现RNAi对染色体的形状有着极大的控制作用。RNAi能永久性关闭或删除一部分DNA,而不只是简单地使DNA暂时沉默。2004年,Tomoko和他的同事们发现一种小dsRNA能够作用于神经基因的表达,并且能在转录水平上直接诱导神经干细胞向神经细胞分化。这种RNA在基因转录水平上直接参与调控,它被命名为smRNA。RNAi广泛存在于自然界随后,RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。随着研究的不断深入,RNAi的机制正在被逐步阐明,而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具,RNAi也越来越为人们所重视。2001年Elbashir等《Nature》上首次报道通过21个核苷酸的siRNA成功地在哺乳动物培养细胞中诱导特异性基因沉默。2、RNA干扰的机制RNAi=RNAinterferencesiRNA=smallinterferingRNAsiRNP=smallinterferingRibonucleoproteinRISC=RNAInducedSilencingComplex越来越多的研究人员开始采用小分子干扰RNA(smallinterferingRNAs,siRNAs)来抑制特定的哺乳动物基因表达。siRNA即为能够以同源互补序列的mRNA为靶目标并将其降解而介导RNA干扰途径的短片断双链RNA分子。如何设计有效的siRNA一直是当前RNAi研究的热点话题,不同的实验室有不同的结果。RNAi作用机制体外实验结果的提示体外实验表明:RNAi反应中,加入的dsRNA被切割为21-23核苷酸长的RNA片段,后者会使目的mRNA被切割为21-23核苷酸长的片段。从已经发生RNAi的果蝇S2细胞中,Hammond等人部分纯化了一种核酸酶,该核酸酶具有序列特异性,它仅降解与引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA。那么这种核酸酶是如何确定哪些mRNA该降解而哪些不该呢?由于在纯化该核酸酶时,可以共分离出21-23核苷酸长的dsRNA片段,这暗示该核酸酶对mRNA的切割有可能是以这些片段作模板指导进行的。根据以上的实验结果,人们提出一种RNAi作用的简单模型。RNAi作用的简单模型当dsRNA导入细胞后,被一种dsRNA特异的核酸内切酶识别,切割成21-23核苷酸长的小片段,这些片段可与该核酸酶的dsRNA结合结构域结合,并且作为模板识别目的mRNA。识别之后,mRNA与dsRNA的有义链发生链互换,原先dsRNA中的有义链被mRNA代替,从酶-dsRNA复合物中释放出来,而mRNA则处于原先的有义链的位置。核酸酶在同样位置对mRNA进行切割,这样又产生了21-23核苷酸长的dsRNA小片段,与核酸酶形成复合物,继续对目的mRNA进行切割,从而使目的基因沉默,产生RNAi现象。通过遗传分析的方法,目前已从线虫中已分离到RDE-2,RDE-3和Mut-7等RNAi相关的基因。RNAi研究的一般技术路线一般设计原则(1)从mRNA的AUG起始密码开始,寻找“AA”二连序列,并记下其3'端的19个碱基序列,作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。(2)将潜在的序列和相应的基因组数据库(人,或者小鼠,大鼠等等)进行比较,排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST.(3)选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA,以找到最有效的siRNA序列。负对照一个完整的siRNA实验应该有负对照。作为负对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成,但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱,同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。3、制备siRNAs的方法

(1)化学合成;

(2)体外转录;

(3)用RNaseIII消化长片断双链RNA制备siRNA。这种方法——制备一份混合有各种siRNAs“混合鸡尾酒”

,siRNA混合物中有许多不同的siRNAs,通常能够保证目的基因被有效地抑制。尽管化学合成是最贵的方法,但是却是最方便的——研究人员几乎不需要做什么工作。许多公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高,定制周期长,特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高,为一个基因合成3-4对siRNAs的成本就更高了,比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。最适用于:已经找到最有效的siRNA的情况下,需要大量siRNA进行研究;不适用于:筛选siRNA等长时间的研究,主要原因是价格因素。化学合成法体外转录相对化学合成法而言成本比较低,是一种性价比高的筛选siRNAs的好方法。更重要的是能够更快的得到siRNAs。值得一提的是体外转录得到的siRNAs只要较低的浓度就可以达到化学合成siRNAs较高浓度得到的效果。不足之处:实验的规模受到限制,虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs,但是反应规模和量始终有一定的限制。最适用于:筛选siRNAs,特别是需要制备多种siRNAs,化学合成的价格成为障碍时。不适用于:实验需要大量的,一个特定的siRNA;长期研究。用RNaseIII消化长片断双链RNA制备siRNA

其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。这种方法——制备一份混合有各种siRNAs“混合鸡尾酒”

就可以避免这个缺陷。这个方法是选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版,用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA

,然后用RNaseIII(orDicer)在体外消化,得到一众siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后,这个siRNA混合物就可以直接转染细胞,方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs,通常能够保证目的基因被有效地抑制。4、RNA干扰的技术流程siRNA(SmallinterferingRNA)的设计与合成siRNA的体内、体外转运RNAi的检测(核酸及蛋白水平)siRNA的一般结构:哺乳动物:21-23bpdsRNA

其它生物:更长的片段dTdT(UU)(UU)dTdT4.1siRNA的设计与合成设计流程(选择siRNA靶位点)从转录本AUG起始密码子开始,搜寻下游AA序列,记录跟每个AA3’端相邻的19个核苷酸作为候选的siRNA靶位点;根据5‘和3’非翻译区(UTR)及靠近起始密码子(75个碱基之内)等富含调节蛋白结合位点区域来设计siRNA。将候选靶位点与相应的基因组数据库比较,去掉哪些与其它编码序列同源的靶序列。设计阴性对照:阴性对照siRNA应与siRNA的核苷酸组成相同但没有与基因组明显同源的序列。一般通过改变siRNA核苷酸顺序并经同源序列比较确证而得。5’UTRCD8ORF3’UTRCD8siRNAsCD8mRNA5’UTRCD4ORF3’UTRCD4mRNACD4siRNAsmRNA被干扰的区域效应++化学合成体外转录(载体/反应体系)DICER/RNaseIII消化dsRNAsiRNA表达框架(siRNAexpressioncassettes,SECs)质粒载体体内转录病毒载体体内转录siRNA的合成体外转录expressionsiRNA表达框架siRNA表达框架

siRNA表达框架(siRNAexpressioncassettes,SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版,能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。这个方法最早是由Castanotto采用,包括一个RNApolIII启动子,一段发夹结构siRNA,一个RNApolIII终止位点。和siRNA表达载体不同的是,SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤,可以直接由PCR得到,不用一天的时间。因此,SECs成为筛选siRNA的最有效工具,甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配!siRNA表达框架如果在PCR两端添加酶切位点,那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后,可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。这个方法的主要缺点是PCR产物很难转染到细胞中。如果有适合的新型转染试剂能提高SEC的转染效率的话,那问题就可以解决了。另外,没有克隆到载体中的PCR片断并不适于大规模制备。最适用于:筛选siRNA序列,在克隆到载体前筛选最佳启动子;不适用于:长期抑制研究。如果克隆到载体后就可以了

72hourspost-transfection,thecellswereassessedusingnuclearstainingwithDAPIandimmunofluorescenceusingac-FOSantibody.Non-transfectedcells(NT)aswellascellstransfectedwithanSECexpressinganegativecontrolsiRNA(scramble)demonstratewild-typelevelsofc-FOS.Therelativelevelofreductioningeneexpressionwasquantifiedandisprovidedinthebargraph.

VariableReductioninTargetGeneExpressionUsingSECswithDifferentPromoters.siRNAExpressionCassettesfeaturingthemouseU6(Mo-U6),humanU6(Hu-U6),andhumanH1(Hu-H1)promotersandencodingac-fos-specifichairpinsiRNAweretransfectedintoHeLacells.

制备siRNA5种不同方法的比较4.2siRNA的体内、体外转运机械法比如显微注射和基因枪(biolisticparticle)电转法脂质体转染法转染细胞siRNAs需要进入细胞后才能对蛋白的表达进行抑制,因此将其高效地转入细胞也是研究成功与否的关键步骤。例如,一个siRNA对某个特定基因表达的抑制效率是90%,但是其转染效率只有10%,那么总的抑制率只有9%。目前传统的转染方法与试剂的效果都不是很理想。但是有专门的RNA转染试剂,其原理也是基于脂质体技术,可用于多种真核细胞的RNAi研究。4.3RNAi的检测(核酸及蛋白水平)RNAi的效果分析可从mRNA和蛋白质两方面进行:mRNA:RT-PCR;定量PCR;Northern杂交等。蛋白质:Western杂交;ELISA;免疫荧光等。细胞的代谢过程,生理生化系数等表型参数的变化是RNAi效果最终和最大的体现。5、RNA干扰的应用研究基因功能的新工具线虫和果蝇的全部基因组序列已测试完毕,发现大量未知功能的新基因,RNAi将大大促进对这些新基因功能的研究。与传统的基因敲除技术相比,这一技术具有投入少,周期短,操作简单等优势。开展基因治疗的新策略

RNAi具有抵抗病毒入侵,抑制转座子活动,防止基因序列过量增殖等作用,因此可以利用RNAi现象产生抗病毒的植物和动物,并可利用不同病毒转录序列中高度同源区段相应的dsRNA抵抗多种病毒。进行药物筛选的工具(1)在功能基因组中的应用在功能基因组研究中,需要对特定基因进行功能丧失或降低突变,以确定其功能。由于RNAi具有高度的序列专一性,可以特异地使特定基因沉默,获得功能丧失或降低突变,因此RNAi可以作为一种强有力的研究工具,用于功能基因组的研究。将功能未知的基因的编码区(外显子)或启动子区,以反向重复的方式由同一启动子控制表达。这样在转基因个体内转录出的RNA可形成dsRNA,产生RNA干涉,使目的基因沉默,从而进一步研究目的基因的功能--RNAi技术。根据所选用序列的不同,可将其分为编码区RNAi和启动子区RNAi技术。

编码区RNAi技术自1998年在线虫中发现RNAi现象以来,以基因编码区为靶序列的编码区RNAi技术已用于线虫功能基因组的研究。最初这种技术是通过注射或浸泡等方法直接导入到线虫的性腺或早期胚胎中。这些方法虽然可以关闭目的基因的表达,产生突变表型,但这种表型变化却不能遗传。这种早期的RNAi技术可以用于研究与胚胎发育有关的基因的功能,但由于细胞分裂造成dsRNA的稀释,使得这种方法在研究成体的基因功能时有一定的局限性。为弥补早期RNAi技术的上述不足,Tavernarakis等对RNAi技术进行了改进,将目的基因的靶序列以反向重复的方式,由热激启动子控制在转基因生物中表达。热激处理后,反向重复序列在细胞内开始转录,其产物会形成具发夹环结构的dsRNA,从而产生RNAi,使目的基因沉默。这种改进的RNAi技术与传统的RNAi技术相比,具有明显的优点:首先转基因可以遗传给后代,有利于突变的分析;其次dsRNA可以被诱导产生,RNAi能够在发育特定阶段出现,从而使研究发育早期必需基因在发育晚期的功能成为可能;另外,当用细胞特异性启动子控制dsRNA的表达时,可以研究特定基因在不同器官中的功能。KennerdellJ.R.和CarthewR.W.用GAL4/UAS系统控制dsRNA在果蝇中的表达,实现了诱导性或细胞特异性控制RNAi的发生。

编码区RNAi技术随着应用RNAi技术研究线虫功能基因组工作的开展,研究人员对该技术在植物中应用的可能性进行了探索。加州理工大学的ChuangC.F.和MegerowitzE.M.使用此技术研究了拟南芥的AG,CLV3,AP1,PAN四个开花相关基因。结果表明使用RNAi技术可以产生功能丧失或降低突变体,其表型与以前通过其它方法鉴定的突变体类似。RNA原位杂交表明,RNAi突变体的目的mRNA显著降低。该结果说明RNAi技术亦可以成为功能基因组研究中的有力工具。编码区RNAi技术启动子区RNAi技术M.F.Mett等证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23核苷酸长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默。由于多基因家族的各成员之间高度同源,因而使用编码区RNAi技术很难将各个成员区分开来研究,而多基因家族内的启动子序列通常比编码区变化大,采用启动子区RNAi技术有望将多基因家族的各个成员区分开来研究。这样综合编码区RNAi技术和启动子区RNAi技术的信息即可更全面地了解多基因家族地各成员的功能。RNAi现象存在的广泛性远远超过人们的预期,对此问题的深入研究结果将为进化的观点提供有力佐证。与其它几种进行功能丧失或降低突变的技术相比,RNAi技术具有明显的优点,它比反义RNA技术和同源共抑制更有效,更容易产生功能丧失或降低突变。而且通过与细胞特异性启动子及可诱导系统结合使用,可以在发育的不同时期或不同器官中有选择地进行,与T-DNA技术造成的功能永久性缺失相比,这是更受科学家偏爱的。作为一种新的、强有力的研究工具,RNAi在功能基因组学领域呈现出巨大的应用前景,成为当今研究领域最引人注意的话题之一。相对于基因敲除技术(knockout),RNAi具有快速、有效、容易操作和序列特异性强等优点,被称为基因抑制(knockdown)技术,是研究特定基因功能的有效方法。因此,在某种程度上可以替代操作复杂和费用昂贵的基因敲除技术。启动子区RNAi技术(2)在基因治疗中的应用

治疗HIV感染由于RNAi是机体中古老而天然的抗病毒机制,HIV病毒感染是我们亟待解决的问题,将RNAi技术应用于艾滋病治疗是顺理成章之事。针对HIV病毒研究有Jacque等设计的抑制HIV1长末端重复序列、附件基因vif和nef表达的siRNA,Lee等针对rev转录子设计的siRNA及Novina等]针对HIV病毒gag基因设计的siRNA,其基本策略都是选择HIV病毒或宿主细胞基因为靶点。治疗肝炎病毒感染JudeLieberman等已经成功地利用RNAi技术治愈了实验鼠的肝炎。他们干扰的目标是“凋亡相关蛋白质(FAS)基因”。FAs存在于细胞表面,它能够启动细胞的自杀程序。据认为,许多肝病是由于病毒、免疫系统失常或慢性酒精中毒激活了FAs基因所导致的。JudeLieberman等给实验鼠尾部血管注入旨在“沉默”FAs基因的siRNA,发现有90%的肝细胞接收到了这种RNA分子,FAs蛋白质的产量变成原先的十分之一。结果,未接受RNAi治疗的实验鼠有40%在3天内死亡。而40只接受过治疗的实验鼠有33只活了下来,10天后研究人员检查这些实验鼠的肝部,发现完全正常。

治疗肿瘤

多种癌基因可以作为靶点设计相对应的siRNA

。Brummelkamp等用逆转录病毒载体将siRNA导入肿瘤细胞中,特异性抑制了癌基因kras(v12)的表达。对急性髓性白血病的研究已经取得了乐观的结果。Scher等以引起慢性髓性白血病和bcrab1阳性急性成淋巴细胞白血病的bcrab1癌基因为靶基因,设计了对应的siRNA,并获得了87%的有效抑制率。Wilda等用siRNA抑制白血病bcr/abl融合基因表达也取得了成功。因此基于RNAi技术的抗肿瘤治疗药物开发潜力巨大。

siRNA表达载体

多数的siRNA表达载体依赖3种RNA聚合酶III启动子(polIII)中的一种,操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。包括的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNApolIII启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA,而且它是通过添加一串(3到6个)U来终止转录的。使用这类载体,需要2段编码短发夹RNA序列的DNA单链,退火,克隆到相应载体的polIII启动子下游。由于涉及到克隆,这个过程需要几天的时间,同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。不过幸好载体容易大量扩增,这个优点足以弥补所有缺陷,特别是当载体在实验中确实有效的时候。siRNA表达载体siRNA表达载体的优点在于这是众多方法中唯一可以进行长期研究的方法——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达,持续数星期甚至更久。即使是对转染带有筛选标记质粒的细胞进行瞬时筛选,也有助于富集带质粒的细胞。这也可以帮助解决一些难转染的细胞由于转染效率低造成的问题。开始研究逆转录病毒和其他病毒载体用于siRNA表达,其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究,避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便。最适用于:已知一个有效的siRNA序列,需要维持较长时间的基因沉默,或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞,长期研究。不适用于:筛选siRNA序列(其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作)

Followingtransfection,thecellswereselectedwithhygromycin.Threeweeksfollowingselection,thecellswereanalyzedforGFPexpressionbyfluorescencemicroscopy.Green:GFP.Blue:DAPIstainednuclei.GFPlevelswereremarkablyreduced(94%)incellstransfectedwiththeGFPsiRNA-encodingpSilencer2.1-U6hygrosiRNAExpressionVectorascomparedtothosetransfectedwithan"empty"siRNAexpressionvector.

HeLacellsexpressingcycle3GFPweretransfectedwithpSilencer2.1-U6hygrocontaininganinsertencodingansiRNAtargetingcycle3GFPorpSilencer2.1-U6hygrowithoutansiRNA-encodinginsert.6、内源性RNAi机制及其作用多年来,生物学家认为RNA在生命过程中的作用仅仅是将遗传信息从DNA传递到蛋白,就象蜂群中的雄蜂般没有创意。

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