第3章 液相色谱分析

第三章

高效液相色谱分析3-1高效液相色谱法3-2流程及主要部件3-3影响分离的因素3-4高效液相色谱法的主要分离类型HighPerformanceliquid

Chromatograph,

HPLC

2023/2/5一、HPLC发展历史§3-1高效液相色谱法简介二、

特点高压、高速、高效、高灵敏度经典LCHPLC2023/2/5§3-1高效液相色谱法简介三、种类四、应用液-固色谱液-液色谱离子交换色谱凝胶色谱生化分析、食品分析、环境分析、医药分析……2023/2/5五高效液相色谱仪组成2023/2/52023/2/5高效液相色谱仪的结构流程图2023/2/5HPLC仪包括：高压输液装置;进样系统;分离系统;检测系统;和数据处理装置。此外还配有梯度淋洗、馏分收集器。

2023/2/51.高压输液系统1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔约2m，可防止颗粒物进入泵内。

脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。2023/2/52）高压泵：要求：密封性好、压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀种类：恒压泵和恒流泵。恒压泵（气动放大泵）：利用大面积的其他活塞驱动小面积液体活塞面，按照活塞面积比，以很小的气体压力可达到相当高的液压把流动相送入色谱柱。体积和重量都很大，现仅作为液相色谱柱的填装泵使用

2023/2/5恒流泵（往复泵）：是目前液相色谱使用最普遍的一种高压泵，优点是泵头内腔体积小，容易清洗，便于换溶剂。单头往复泵：单头往复泵依靠变速同步电机驱动曲轴，然后带动宝石柱前后往复运动，流动相则从下面通过单向阀吸入泵体，并由上部通过单向阀送出。改变冲程频率可以控制流速双头往复泵：由电机带动凸轮转动，两个宝石柱塞杆随之往复运动、吸入和送出流动相。因为两个柱塞杆来回移动有一个时间差，正好补偿流动相输出的脉冲，使得流速相当平稳2023/2/52.梯度洗提装置：梯度洗提：就是载液中含有两种或两种以上不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组分的容量因子和选择因子，以提高分离效果。应用梯度洗提可以提高分离效果，缩短分析时间，提高分辨能力和定量分析的精度。注意：（1）溶剂纯度高，以保证良好的重现性（2）溶剂需互溶，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相（3）每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态2023/2/53.进样系统进样装置包括两种：1）微量注射器进样：2023/2/52）高压定量进样阀：常用的为六通阀。进样量由样品管控制，进样准确，重复性好。2023/2/54.色谱柱1）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。柱长多为15~30cm，内径为4.6或3.9mm标准柱。2）柱的填充：

主要采用匀浆法。常用的匀浆试剂有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等；常用的填料是新型健合相填料，粒度3-10微米。

填充方法：填充时，先制作匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中，然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要求填充速度快(防凝聚、沉降或结块)、且无空气进入。2023/2/5

（l）紫外检测器

（2）荧光检测器

（3）示差折光率检测器

（4）电导检测器

5.检测器作用？——将经色谱柱分离后的各组分按其特性及含量转换为相应的电信号。HPLC检测器类型2023/2/5

特点：灵敏度高，最小检测浓度达10-9g/mL；流通池体积小（容积8-10μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱

应用最广，对大部分有机化合物有响应(1).紫外检测器（Ultrvioletphotometricdetector）2023/2/52023/2/5紫外普通检测器和光电二极管阵列检测器的比较普通检测器光电二极管阵列检测器2023/2/5波长可的松氟美松皮质酮由光电二极管阵列（PDA）检测所获得的三维色谱-光谱图。利用色谱保留值及光谱特征吸收曲线综合进行定性分析。2023/2/5(2).荧光检测器（fluorescencedetector）特点：高灵敏度，最小检测浓度达10-11g/mL；高选择性，对具有共轭结构的有机芳环分子(刚性结构强)有响应。

如多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、甾类化合物等有响应.2023/2/5(3).示差折光检测器（differentialrefractiveindexdetector）检测原理：连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与流动相中的组分浓度成正比；2023/2/5通用型检测器（不同的物质具有不同的折光指数）；

灵敏度低10-7g/mL。对温度敏感(检测器温度应控制在±10-3℃)梯度洗脱会造成流动相折光指数不断变化，故不能用于梯度洗脱。

特点：2023/2/5电导检测器属于电化学检测器，主要用于离子色谱的检测。检测原理：基于待测物在一些介质中解离后所产生的电导变化来测量解离物质的含量。特点：通用型检测器，检测灵敏度低。背景电导低时，采用双电极电导检测器(p90,图3-13）。当背景电导大时，应采用五电极式电导检测器(p91,图3-15)

响应受温度影响较大，需要将电导池置于恒温箱中。当pH>7时，该检测器不够灵敏。

(4).电导检测器（electricalconductivitydetector）2023/2/5

在高效液相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，而只有两项，即：

H=A+Cu

如图所示：H～u曲线是一段斜率不大的直线。而在高的流动相流速下不致于使柱效损失太大，所以在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要参数。流速大于0.5cm/s时,降低流速，柱效提高不是很大。§3-3影响HPLC分离的因素2023/2/5A─涡流扩散项

A=2λdp

dp：固定相的平均颗粒直径λ：固定相的填充不均匀因子Cu─传质阻力项传质阻力包括固定相传质阻力Cs和流动相传质阻力Cm(包括在流动的流动相中的传质和滞留的流动相中的传质)：

C=（Cs+Cm+Csm）柱内色谱峰展宽引起H的变化：2023/2/5提高液相色谱的柱效方法：

柱填充颗粒小且均匀；流动相流速较低，粘度要小；柱温高

流速选择原则：柱效损失不太大的前提下提高流动相流速以实现快速分离。2023/2/5影响色谱峰扩展的因素的柱外因素：

柱前展宽：由进样引起。若将试样直接注入到色谱柱顶端填料中心点，或注入到填料中心之内1-2mm处，可减小柱前展宽，提高柱效。

柱后展宽：由接管，检测器流通池的死体积所引起。2023/2/5一、液—液分配色谱原理

根据各待测物在互不相溶的液体中溶解度不同，具有不同的分配系数。在色谱柱中，随着流动相的移动，这种分配平衡需进行多次，造成各待测物的迁移速率不同，从而实现分离的过程。

§3-4高效液相色谱的主要类型及分离原理按分离原理，HPLC分离的主要类型？

用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。2.应用2023/2/53.固定相

液液色谱的固定相选择较简单，常用的只有几种，如,’-氧二丙腈、聚乙二醇、十八烷(C18)、角鲨烷。固定相涂渍方法:1）机械涂渍固定相：将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型(0.5-1.5%涂布量)或全多孔型载体上(5-10%涂布量)。该种固定相最大的不足是固定液易流失、分离稳定性及重现性差，不适合梯度淋洗。

如何减少固定液的流失？

机械涂渍型和化学键合型。2023/2/5

如何减少固定液的流失？方法一、固定相和流动相之间溶解度越小越好（两者极性差别越大越好）

方法二、在柱前加一根很短的前置柱(该柱涂有与分析柱相同但有更高含量的固定液，使流动相进入分析柱之前，预先被固定液饱和)或将固定液健合到载体上。方法三、使固定液在担体上结合更牢固2023/2/52）化学键合固定相通过化学反应将各种不同的有机基团键合到载体(硅胶)表面所形成的柱填充剂，具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。这种固定相分离机理：液液分配？双重分离机制，即液液分配+吸附取决于化学键合的表面覆盖率。

高覆盖率：液液分配为主；低覆盖率：吸附为主。化学键合固定相的类型：2023/2/5化学键合固定相类型

a.硅氧碳键型：≡Si—O—C

≡Si－0H＋ROH→≡Si－OR＋H20

b.硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si—

C

稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；

c.硅碳键型：≡Si—Cd.硅氮键型：≡Si—N2023/2/54.流动相:

在液液色谱中，为防止固定相的流失，流动相液体与固定液应尽量不互溶，或者说二者的极性相差越大越好。因此，根据流动相与固定相极性的差别程度，可将液液色谱分为正相分配色谱（流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离）和反相分配色谱（流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离）。反相健合相色谱法固定相:硅胶一C18H37、硅胶一苯基等流动相:甲醇\乙睛一水、水+无机盐buf溶液等正相健合相色谱法固定相:硅胶一OH、硅胶一CN等流动相:正已烷中加入适量极性溶剂,如氯仿\醇等2023/2/5A>B>C正相色谱低极性流动相反相色谱高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间正、反相色谱中极性和保留时间的关系?待测物极性：2023/2/5二、液固吸附色谱

固定相:固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等，粒度5～10μm。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。作用机理：根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。当流动相进入色谱柱后，它以单分子层S形式占据吸附剂上的活性中心点，当试样分子X进入色谱柱后，在迁移过程中，与流动相分子在固定相表面发生竞争吸附反应：这种竞争吸附达平衡时，吸附的分配系数K为：K越大，溶质分子的吸附性强，保留值大。应用：相对分子质量中等的油溶性样品，不同官能团化合物、异构体。

2023/2/5三、离子对色谱法（IPC）

原理主要是基于待测组分在分析柱上的吸附作用不同而进行分离的。将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对化合物，利用它在流动相和固定相之间的分配系数不同而进行分离。

固定相疏水性的苯乙烯、二乙烯苯树脂或键合的硅胶流动相水+离子对试剂+有机溶剂

离子对试剂所带电荷与待测离子相反的离子2023/2/5可以通过改变对离子的浓度和种类，流动相的类型、浓度及pH值从而改变分离的选择性，解决难分离混合物的分离问题。平衡常数KXY为:

根据分配系数的定义，溶质的分配系数D为：例如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，于流动相中加入与待测离子X+有相反电荷的离子Y-：

2023/2/52离子对试剂的选择（1）分离亲水性离子——选用疏水性离子对试剂分离疏水性离子——选用亲水性离子对试剂（2）相对分子量较小的离子对试剂比分子量的分离效果更好2023/2/5思考题：有一强极性有机酸混合物，若用离子对色谱法分离，请问在流动相中应加入阴离子还是阳离子来形成离子对？离子对色谱法的应用分离大分子量的阴、阳离子，特别是带局部电荷的大分子及疏水性阴、阳离子。包括阴阳离子表面活性剂，大分子脂肪羧酸、烷基磺酸盐和芳香硫酸盐、季铵化合物、水溶性维生素、酚类等2023/2/5

IEC是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。四、离子交换色谱（IEC）1.原理固定相为离子交换树脂，可解离出离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换利用不同待测离子对固定相的亲和能力（或离子交换能力）的差别来实现分离的。2023/2/52023/2/52.固定相作为固定相的离子交换剂，其基质大致有三大类：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶。离子交换剂有阳离子交换剂和阴离子交换剂。2023/2/5一般形式：R一A＋B＝R－B＋A

对于典型的磺酸型阳离子交换树脂，一价离子的对树脂的亲和力大小顺序为：Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li+二价离子的顺序为：Ba2+＞Pb2+＞Sr2+＞Ca2+＞Cd2+＞Cu2+，Zn2+＞Mg2+对于季铵型阴离子交换树指，阴离子的选择性顺序为：

ClO4-＞I-＞HS04-＞SCN-＞NO2-＞Br-＞CN-＞Cl-＞BrO3-＞OH-＞HCO3-＞IO3-＞CH3COO-＞F-2023/2/5凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。4.应用3.流动相

盐类缓冲溶液（有一定pH和离子强度）。通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和pH值可控制k值，改变选择性。2023/2/5产生背景：离子交换色谱法淋洗液几乎都是强电解质，电导比待测离子高两个数量级，被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景电导信号掩没而无法用电导检测器检测；而多数无机离子没有紫外吸收，不能用紫外检测器检测。

五、离子色谱离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。2023/2/5

例如：分析阴离子时，则发生下列反应：R+—OH+NaBr

R+—Br-+NaOH流动相的高背景电导如何转化成低的背景电导？1975年，美国DOWChemical公司H.Small等人引入抑制柱（SuppressorColumn）2023/2/5

R—H++NaOH

R—Na++H2OR—H++NaBr(待测物)R—Na++HBr

由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量碱转变为电导很小的水，消除了流动相本底电导的影响。同时，又将样品阳离子Br-转变成相应的酸HBr，提高了检测灵敏度。

在分离柱后加一个抑制柱的离子色谱称为抑制型离子色谱或称双柱离子色谱。由于抑制柱要定期再生，而且谱带在通过抑制柱后会加宽，降低了分离度。后来，Frits等人提出采用电导率极低的流动相溶液，例如用1×10-4～5×10-4mol/L苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐的稀溶液作流动相，称为非抑制型离子色谱或单柱离子色谱。2023/2/5六、空间排阻色谱法（SEC）又称凝胶色谱法，主要用于大分子的分离。凝胶渗透色谱法：以有机溶剂作流动相，多用于高分子领域，测定聚合物分子量分布或跟踪聚合物合成、降解反应。凝胶过滤色谱法：以水或水溶液为流动相，多用于生化领域分离天然高分子。1.分离原理基于待测物分子的尺寸和形状不同来实现分离

固定相：为化学惰性、具有一定孔径的多孔凝胶（孔径：数nm~数百nm，大于分子筛的孔径）。2023/2/5凝胶内有一定大小的空穴，体积大的待测物分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。这样，样品分子基本上按其分子大小，先后由柱中流出。2023/2/5

2.特点

（1）保留时间是分子尺寸的函数；

（2）保留时间短，谱峰窄，易检测；（3）固定相与分子间作用力极弱，趋于零。因此柱寿命长。（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必须大于10％才能得以分离。2023/2/53.固定相类型固定相流动相特点应用软性凝胶葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶以水溶性溶剂作流动相微孔能吸入大量的溶剂，不适宜用在HPLC用于小分子质量物质的分析半刚性凝胶高交联度的聚苯乙烯、聚乙酸酯以有机溶剂作流动相溶胀性不如软性凝胶，用于HPLC时，流速不宜大用于大分子质量物质的分析刚性凝胶多孔硅胶、多孔玻璃既可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流动相刚性大，溶胀小可在较高压强和较高流速下操作用于大分子质量物质的分析2023/2/54.流动相2023/2/5§3-7高效液相色谱分离类型的选择2023/2/51．根据相对分子质量选择相对分子质量十分低的样品，其挥发性好，适用于气相色谱。标准液相色谱类型（液一固、液一液、及离子交换色谱）最适合的相对分子质量范围是20O～2000。对于相对分子质量大于2000的样品，用排阻色谱法为最佳。2．根据样品溶解度选择弄清样品在水、异辛烷、苯、四氯化碳、异丙醇中的溶解度。如果样品可溶于水且能离解，采用离子交换色谱为佳；如样品可溶于烃类(如苯或异辛烷)，则可采用液一固吸附色谱；如样品溶解于四氯化碳，则多采用常规的分配和吸附色谱分离；如样品既溶于水又溶于异丙醇时，常用水和异丙醇的混合液作液一液分配色谱的流动相，以憎水性化合物作固定相。2023/2/53．根据分子结构选择用红外光谱法，可预先简单地判断样品中存在什么官能团。然后，确定采用什么方法合适。例如:酸、碱化合物用离子交换色谱；脂肪族或芳香族用液一液分配色谱、液一固吸附色谱；异构体用液一固吸附色谱；同系物不同官能团及强氢键的用液一液分配色谱。现列出表3-3作为选择分离类型的参考。2023/2/5

表3-3液相色谱分离类型选择参考表

相对分子质量溶于水——排阻色谱，水为流动相＞2000不溶于水——排阻色谱，非水流动相同系物——分配色谱不溶于水异构体——吸附色谱样品