第13章-细胞衰老与凋亡

第十三章细胞衰老与凋亡

(cellsenescingandapoptosis）

第一节细胞的衰老衰老(senescing，aging)：是机体在退化时期生理功能下降和紊乱的综合表现,是不可逆的生命过程。个体的衰老与细胞的衰老相关联。现代人类面临着3种衰老：◆生理性衰老◆病理性衰老◆心理性衰老癌细胞或培养的细胞系是不正常细胞，其染色体数目或形态已经不同于原先的细胞。培养细胞的增殖能力与供体年龄有关。培养细胞寿命与物种寿命之间存在着一定的关系。细胞来源人胚肺成纤维细胞中年人成纤维细胞老年人成纤维细胞可增殖代数40-60202-4不同年龄来源的人成纤维细胞的增殖代数体外培养的年轻人和老人的成纤维细胞的显微形态组织块迁移法获得的bMGEs细胞生物学特征

A贴壁的乳腺上皮细胞形成的管状结构（×100）Tube-likestructureofbMGEs（×100）D

乳腺上皮细胞形成单克隆（×100）

MonocloneofbMGEs（×100）C

原代培养牛乳腺上皮细胞（×100）ThebMGEsinisolatedforprimaryculture（×100）A不同形态牛乳腺上皮细胞（×100）DifferentmorphologicalofbMGEs（×100）B乳腺上皮细胞分泌脂滴（×100）Lipiddroplets-LikeofdifferentiatedbMECs（×100）乳腺上皮细胞分化的管腔（×100）Tube-likestructureofbMGEs（×100）F

乳腺上皮细胞分化的分泌泡（×100）SecretoryvacuoleofdifferentiatedbMECs（×100）H衰老的乳腺上皮细胞×100SenescenceofbMECs×100IEA贴壁的乳腺上皮细胞形成的管状结构（×100）Tube-likestructureofbMGEs（×100）D

乳腺上皮细胞形成单克隆（×100）

MonocloneofbMGEs（×100）C

原代培养牛乳腺上皮细胞（×100）ThebMGEsinisolatedforprimaryculture（×100）A不同形态牛乳腺上皮细胞（×100）DifferentmorphologicalofbMGEs（×100）B复制衰老：体外培养的正常细胞经过有限次数的分裂后，停止分裂，细胞形态和生理代谢活动发生显著的改变现象。（但基本代谢过程仍能维持）迄今为止，除了胚胎干细胞和肿瘤细胞，来自不同生物、不同年龄的原代培养的细胞均存在复制衰老的现象。复制衰老与生物体衰老的联系大多数生物学家认为复制衰老与生物体整体衰老相关,是体内衰老现象的一种体外反映。随着生物体年龄的增加,衰老细胞不断在体内积聚。1965年Hayflick最早提出复制衰老是“衰老在细胞水平的表现”Hayflick界限1961年，Hayflick等人首次报道了体外培养细胞有分裂极限的现象。他利用来自胚胎和成体的成纤维细胞进行体外培养，发现胚胎的成纤维细胞分裂传代50次后开始衰退和死亡，而来自成年组织的成纤维细胞只能培养15～30代就开始死亡。Hayflick界限：指细胞的增殖能力和寿命不是无限的，而是有一定的界限。单独培养混合培养增殖旺盛增殖次数少增殖情况与单独培养时相同探究：人体细胞衰老是由细胞本身决定的还是环境因素决定的？实验结果发现：年轻细胞的胞质体与年老的完整细胞融合时，得到的杂种细胞不能分裂；而年老细胞的胞质体与年轻的完整细胞融合时，杂种细胞的分裂能力与年轻细胞几乎相同。实验证明：是细胞核决定了细胞衰老。对于细胞来说，衰老是不可避免的，衰老的原因在于细胞本身。探究：调控细胞衰老的物质在细胞质还是在细胞核呢？Hayflick比较了不同生物的胚成纤维细胞在体外培养条件下的传代数和寿命，发现物种寿命与培养细胞寿命之间存在着确定的相关关系。正常儿童与早老症儿童的比较通常在13岁左右因心脏病发作或中风等而死亡

衰老细胞结构的变化

细胞核的变化：体外培养的二倍体细胞，细胞核随着细胞分裂次数的增加不断增大；细胞核的核膜内折（invagination）、染色质固缩化；内质网的变化：衰老动物内质网成分弥散性地分散于核周胞质中，粗面内质网的总量似乎是减少了；线粒体的变化：通常细胞中线粒体的数量随龄减少，而其体积则随龄增大；致密体的生成：脂褐质，老年色素等膜系统的变化：衰老的细胞，其膜流动性降低、韧性减小。衰老细胞间间隙连接减少；细胞膜内（P面）颗粒(紧密连接蛋白)的分布也发生变化（减少）。

致密体（densebodies）是衰老细胞中常见的一种结构，是由溶酶体或线粒体转化而来。致密体的其它名称，如脂褐质（lipofuscin）、老年色素（agepigment）、血褐质（hemofuscin）、脂色素（lipochrome）、黄色素（yellowpigment）、透明蜡体（hyaloceroid）及残体（residualbodies）等。细胞形态变化总体来说老化细胞的各种结构呈退行性变化。衰老细胞的形态变化表现有：1、核：增大、染色深、核内有包含物2、染色质：凝聚、固缩、碎裂、溶解3、质膜：粘度增加、流动性降低4、细胞质：色素积聚、空泡形成5、线粒体：数目减少、体积增大6、高尔基体：碎裂7、尼氏体：消失（粗面内质网常呈现规则的平行排列，游离核糖体分布于其间，它们在光镜下呈嗜碱性颗粒或小块，称尼氏体）8、包含物：糖原减少、脂肪积聚包含物在细胞质中，除细胞器外，还有一些其他有形成分，它们有的是细胞的代谢产物，有的是储存的营养物质9、核膜：内陷分子水平的变化

衰老细胞会出现脂类、蛋白质和DNA等细胞成分损伤，细胞代谢能力降低，主要表现在以下方面：DNA：复制与转录受到抑制，但也有个别基因会异常激活，端粒DNA丢失，线粒体DNA特异性缺失，DNA氧化、断裂、缺失和交联，甲基化程度降低。RNA：mRNA和tRNA含量降低。蛋白质：含成下降，细胞内蛋白质发生糖基化、氨甲酰化、脱氨基等修饰反应，导致蛋白质稳定性、抗原性，可消化性下降，自由基使蛋白质肽断裂，交联而变性。氨基酸由左旋变为右旋。酶分子：活性中心被氧化，金属离子Ca2+、Zn2+、Mg2+、Fe2+等丢失，酶分子的二级结构，溶解度，等电点发生改变，总的效应是酶失活。脂类：不饱和脂肪酸被氧化，引起膜脂之间或与脂蛋白之间交联，膜的流动性降低。

细胞核的核膜内折、染色质固缩化。

细胞衰老的分子机制

氧化性损伤学说：代谢过程中产生的活性氧基团或分子（reactiveoxygenspecies，ROS。包括超氧自由基、羟自由基和H2O2），引发的氧化性损伤的积累，最终导致衰老。端粒与衰老：端粒长度随年龄增长而下降，提出细胞衰老的“有丝分裂钟”学说（Harley,1990）：随着细胞的每次分裂，端粒不断缩短，当端粒长度缩短到一个阈值时，细胞就进入衰老。线粒体DNA与衰老：随年龄增长，线粒体DNA突变相当显著，mtDNA的突变积累与细胞衰老有关。TelomerehTERT-bMGEs端粒长度检测

hTERT-bMGEs在5代，12代，18代，27代端粒平均TRF为17.73kb±0.80kb衰老的机理学说关于衰老的机理具有许多不同的学说，概括起来主要有差错学派（Errortheories）和遗传学派（Genetic/Programmedtheories）两大类，前者强调衰老是由于细胞中的各种错误积累引起的，后者强调衰老是遗传决定的自然演进过程。其实，现在看来两者是相互统一的。（一）差错学派细胞衰老是各种细胞成分在受到内外环境的损伤作用后，因缺乏完善的修复，使“差错”积累，导致细胞衰老。根据对导致“差错”的主要因子和主导因子的认识不同，可分为不同的学说，这些学说各有实验证据。（二）遗传学派认为衰老是遗传决定的自然演进过程，一切细胞均有内在的预定程序决定其寿命，而细胞寿命又决定种属寿命的差异，外部因素只能使细胞寿命在限定范围内变动1．程序性衰老（programmedsenescence）2．复制性衰老（replicativesenescence）3．长寿基因（longevitygenes）

第二节细胞凋亡(Apoptosis)

细胞死亡是维持组织机能和形态所必需的。细胞死亡有3种方式：即①细胞坏死（necrosis）。②细胞凋亡（apoptosis）。③细胞自噬（autophagy）

虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但它们的过程与表现却有很大差别。细胞坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用，引起细胞无序变化的死亡过程。细胞凋亡(apoptosis）：是一个主动的由基因决定的自动有序结束生命的过程。细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程序化调控，也称为细胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）。细胞自噬(autophagy)：是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。该过程中一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后，送入溶酶体(动物）或液泡（酵母和植物）中进行降解并得以循环利用。

◆细胞凋亡的意义：细胞凋亡对于多细胞生物个体发育的正常进行，自稳平衡的保持以及抵御外界因素的干扰等方面起着关键的作用。●清除多余无用的细胞。●组织细胞的更新。细胞凋亡与坏死是两种截然不同的细胞学现象。主要特征区别：细胞凋亡：细胞质膜反折，包裹断裂的染色质片段或细胞器，逐渐分离形成众多的凋亡小体（apoptoticbodies），凋亡小体被邻近的细胞吞噬。整个过程中，细胞质膜保持完整，细胞内容物不会逸散到胞外，不引发炎症反应。细胞坏死：表现为细胞胀大，细胞质膜发生渗漏，细胞内容物释放到胞外，核变化较慢，DNA降解不充分，引起局部严重的炎症反应。坏死细胞凋亡细胞正常细胞与细胞凋亡比较细胞凋亡的形态学特征细胞凋亡在形态学上可分为三个阶段：（1）凋亡的起始。细胞凋亡的起始，染色质固缩、分离并沿核膜分布，细胞质亦发生固缩；（2）凋亡小体的形成。细胞质膜反折，包围细胞碎片，如染色质片断和细胞器，形成芽状突起，以后逐渐分隔，形成凋亡小体；（3）凋亡小体逐渐为邻近的细胞所吞噬并消化。细胞凋亡的生化特征细胞凋亡的主要特征是发生核小体断裂，形成大小为180～200bp特征性的梯状条带(DNAladders)。是鉴定细胞凋亡最可靠的方法。凋亡细胞tTG(组织转谷氨酰胺酶,tissueTransglutaminase)积累并达到较高水平。细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图1．细胞色素c诱导0h2．细胞色素c诱导1h3．细胞色素c诱导2h4．细胞色素c诱导3h5．细胞色素c诱导4h6．阴性对照7．Marker有关细胞凋亡的研究表明，细胞色素C与细胞凋亡有关，从线粒体中泄露出的细胞色素C有诱导细胞凋亡的作用。细胞凋亡的检测◆形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察。◆DNA电泳：DNA片段就呈现出梯状条带。◆TUNEL测定法，即DNA断裂的原位末端标记法。能对DNA分子中3’-OH断裂缺口进行原位标记。◆彗星电泳法（cometassay）。◆流式细胞分析。经相差显微镜观察，细胞经羟自由基（·OH）处理后，逐渐变圆，失去与周围细胞的联系，而最终从瓶壁脱落下来；而对照组显示正常的细胞形态。

彗星电泳法（cometassay）的原理是将单个细胞悬浮于琼脂糖凝胶中，经裂解处理后，再在电场中进行短时间的电泳，并用荧光染料染色，凋亡细胞中形成的DNA降解片段，在电场中泳动速度较快，使细胞核呈现出一种彗星式的图案，而正常的无DNA断裂的核在泳动时保持圆球形，这是一种快速简便的凋亡检测法。hoechst33258染色：细胞发生凋亡时，染色质会固缩。所以Hoechst染色时，细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。致密浓染的凋亡细胞正常细胞核凋亡细胞免疫荧光图片hTERT-bMGEs的克隆胚囊胚内细胞凋亡率的鉴定图7-5hTERT-bMGEs的囊胚内细胞凋亡情况的观察(蓝色为DAPI染的细胞核，绿色为FITC标记的凋亡细胞)A:hTERT-bMGEs-28得到的囊胚；B：bMGEs-10培养得到的囊胚Fig7-2ObservationofapoptosisinblastocystsderivedfromhTERT-bMGEs(Blueindicatescellnuclei,Greenindicatesapoptoticcells)A:blastocystderivedfromhTERT-bMGEs-28.2;B:blastocystderivedfrombMGEs-10A’ABB’DAPI荧光染色显示，细胞核皱缩，染色质凝聚碎裂，形成凋亡小体；对照细胞核呈现均匀，明亮的荧光。

2002年10月7日，英国人悉尼·布雷诺尔、美国人罗伯特·霍维茨Horvitz和英国人约翰·苏尔斯顿Sulston，因在器官发育的遗传调控和细胞程序性死亡方面的研究，获诺贝尔生理与医学奖。“fortheirdiscoveriesconcerninggeneticregulationoforgandevelopmentandprogrammedcelldeath”三、细胞凋亡的分子机制

细胞凋亡的途径主要有两条，一条是通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶caspase、一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase。这些活化的caspase可将细胞内的重要蛋白降解，引起细胞凋亡。细胞凋亡的调控涉及许多基因，包括一些与细胞增殖有关的原癌基因和抑癌基因。其中研究较多的有ICE(白介素1转化酶)、Apaf-1(凋亡酶激活因子)、Bcl-2(B淋巴细胞瘤-2)、Fas/APO-1、c-myc、p53、ATM(共济失调一毛细血管扩张突变基因)等。Caspase家族与凋亡Caspase家族(天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶,cysteineaspartate-specificprotease)：是引起细胞凋亡的关键酶，一旦被信号途径激活，能将细胞内的蛋白质降解，使细胞不可逆的走向死亡。Caspase蛋白酶的特点：①酶活性依赖于半胱氨酸(Cysteine)残基的亲核性；②特异性的切割靶蛋白天冬氨酸残基上的肽键。③都是由两大、两小亚基组成的异四聚体，大、小亚基由同一基因编码，前体被切割后产生两个活性亚基。已经鉴定了十多种不同的CaspaseCaspase-3、6、7和8，在FAS/TNF介导的程序性细胞死亡途径中起作用。Caspase-9和3，参与线粒体中Apaf-I、细胞色素c介导的程序性细胞死亡。能够被Caspase切割的靶蛋白：蛋白激酶；核纤层蛋白；细胞结构蛋白；与DNA修复相关的酶类；DNase抑制蛋白。Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活依赖于其它的Caspase在其天冬氨酸位点裂解活化或自身活化。caspase超家族成员A：3类caspase：蓝色参与炎症反应，红色为执行者，绿色为启动者；B：caspase-3的结构模型；C：caspase-3的活化过程白介素-1β转换酶与线虫ced-3同源Executionercaspase在程序性细胞死亡中的作用凋亡酶激活因子Apaf-1Apaf-1（凋亡酶激活因子-1，apoptoticproteaseactivatingfactor-1），Apaf-1具有激活Caspase-3的作用，而这一过程又需要细胞色素c和caspase-9参与。Apaf-1/细胞色素c复合体与ATP/dATP结合后，Apaf-1就可以通过其CARD结构域（caspase活化和募集结构域）召集caspase-9，形成凋亡体（apoptosome），激活caspase-3，启动caspase级联反应。Bcl-2，凋亡抑制基因

Bcl-2为凋亡抑制基因，它们在线粒体参与的凋亡途径中起调控作用，能控制线粒体中细胞色素c等凋亡因子的释放。

根据功能和结构可将Bcl-2基因家族分为两类：一类是抗凋亡的（anti-apoptotic），如：Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1；一类是促进凋亡的（pro-apoptotic），如：Bax、Bak、Bad、Bid、Bim。

Bcl-2主要定位于线粒体外膜，它拮抗促凋亡蛋白的功能。而大多数促凋亡蛋白则主要定位于细胞质，一旦细胞受到凋亡因子的诱导，它们可以向线粒体转位，通过寡聚化在线粒体外膜形成跨膜通道，从而导致线粒体中的凋亡因子释放，激活caspase，导致细胞凋亡。其他凋亡相关基因Fas：属TNF受体家族。分布于胸腺细胞。Fas蛋白与Fas配体结合后，会激活caspase，导致靶细胞走向凋亡。P53：是一种抑癌基因，在G期监视DNA的完整性。如有损伤，则抑制细胞增殖，直到DNA修复完成。如果DNA不能被修复，则诱导其调亡。Myc：能促进细胞增殖、抑制分化。在凋亡细胞中c-myc也是高表达，作为转录调控因子，一方面它能激活那些控制细胞增殖的基因，另一方面也激活促进细胞凋亡的基因，给细胞两种选择：增殖或凋亡ATM：是与DNA损伤检验点的一个重要的蛋白激酶。DNA损伤会激活修复机制，如DNA不能修复则诱导细胞凋亡。哺乳动物细胞凋亡的途径死亡受体途径：由细胞表面受体启动，直接激活下游caspase，这些受体属于肿瘤坏死因子/神经生长因子（TNF/NGF）受体超家族。线粒体途径：通过线粒体释放CytC，间接激活下游caspase。1、死亡受体途径细胞表面的凋亡受体是属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族的跨膜蛋白，它们包括Fas（Apo-1/CD95）、TNFR1、DR3/WSL、DR4/TRAIL-R1和DR5/TRAIL-R2。其配体属于TNF家族，目前已比较清楚的是Fas介导的细胞凋亡途径。Fas具有三个富含半胱氨酸的胞外区和一个称为死亡结构域（Deathdomain，DD，的胞内区。Fas的配体FasL（Fasligand）与Fas结合后，Fas三聚化使胞内的DD区构象改变，然后与接头蛋白FADD（Fasassociateddeathdomain）的DD区结合，FADD的N端DED区（deatheffectordomain）就能与Caspase-8（或-10）前体蛋白结合，形成DISC(death-inducingsignalingcomplex)。DISC引起caspase-8、10通过自身剪激活，它们启动caspase的级联反应，使caspase-3、-6、-7激活，这几种Caspase可降解胞内结构蛋白和功能蛋白，最终导致细胞凋亡。死亡配体,如Fas配体(Fasligand,FasL)↓死亡受体,如Fas、TNFR家族、TGF-BR等↓FADD↓procaspase8↓caspase8↓proca