第2章蛋白质的构件-氨基酸

第2章

蛋白质的构件-氨基酸(aminoacid)一、蛋白质的化学组成和分类1.元素组成蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、锌和铜等。碳和氮元素在蛋白质中的组成百分比约为：碳：50%;氮：16%。2.蛋白质的估算平均含氮量约为16%，所以，可以根据样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量：蛋白质含量=蛋白氮×6.253.氨基酸组成蛋白质是由20种L-型α氨基酸组成的长链分子4.蛋白质的分类1）按组成：简单蛋白质（表2－1）：缀合蛋白质（表2－1）：（注意辅基的组成）2）按生物学功能分：酶、运输蛋白、营养和贮存蛋白、激素、受体蛋白、运动蛋白、结构蛋白、防御蛋白等。3）按形状和溶解度：纤维状蛋白质：不溶于水,结构作用；球状蛋白质：易溶于水，细胞中大多属可溶性蛋白；膜蛋白质：不溶于水,与细胞的各种膜系统结合。酸水解：H2SO4或HCI能使蛋白质完全水解；不引起消旋作用，但色氨酸完全被破坏，天冬酰胺、谷胺酰胺脱酰胺基；碱水解：NaOH能使蛋白质完全水解；色氨酸稳定，但大多数氨基酸遭破坏并引起消旋现象；酶水解：部分水解；不产生消旋，不破坏氨基酸；主要用于蛋白质一级结构分析，如：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等。二、蛋白质的水解

三、氨基酸的一般结构

结构通式：与羧基相连的Cα上都有一个氨基，氢原子和可变的R基。如图aa结构通式：除Gly外

,Cα是不对称C：1.具有两种立体异构体[D-型和L-型]2.具有旋光性[左旋（-）或右旋（+）]四、氨基酸的分类（一）基本氨基酸：组成蛋白质的常见氨基酸（有20种）。（二）不常见的蛋白质氨基酸：不常见但在某些蛋白质中存在。是多肽合成后由基本aa经酶促修饰而来(约10种)。（三）非蛋白质氨基酸：存在于生物体内但不参与蛋白质组成的氨基酸(约200多种)。按R基的化学结构：中性氨基酸1.脂肪族氨基酸含羟基或硫的氨基酸酸性氨基酸及其酰氨碱性氨基酸2.芳香族氨基酸3.杂环族氨基酸（一）

常见的蛋白质氨基酸（20种）（1）中性氨基酸（5种，甘丙缬亮异）R基均为中性烷基，R基对分子酸碱性影响很小。Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性。1.脂肪族氨基酸（2）R中含有羟基和硫的氨基酸（共4种，丝苏半甲硫）Cys的R中含巯基（-SH），具有重要性质：两个Cys的巯基氧化生成二硫键，生成胱氨酸。Met在生物合成中是一种重要的甲基供体（★）。（3）酸性氨基酸及其酰胺基团（各2种，天谷酸酰胺）Asp和Glu是唯一在生理条件下带有负电荷的的两个氨基酸；（4）碱性氨基酸（2种，赖精脂肪酸）Arg是碱性最强的氨基酸，是动物体内尿素形成的中间物。

2.芳香族氨基酸（3种，苯丙色酪香）苯丙氨酸酪氨酸色氨酸

3.杂环氨基酸（2种，杂环带组脯）Pro的α-亚氨基是环的一部分，因此具有特殊的刚性结构，一般出现在两段α-螺旋之间的转角处，Pro残基所在的位置必然发生骨架方向的变化；His带有咪唑基，是在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸。His在酶的酸碱催化机制中起重要作用。按R基的极性性质：1.非极性R基氨基酸8（丙、缬、亮、异亮、脯、苯丙、色、甲硫）

2.不带电荷的极性R基氨基酸7（甘、丝、苏、半胱、酪、谷氨酰胺、天冬酰胺）

3.带正电荷的R基氨基酸3（赖、精、组）

4.带负电荷的R基氨基酸2（谷、天冬）极性

1.非极性R基氨基酸（8种）在水中的溶解度小，且在维持蛋白质的三维结构（蛋白质的疏水核心）中起着重要作用。2.不带电荷的极性R基氨基酸（7种）这类氨基酸的侧链都能与水形成氢键，因此很容易溶于水。羟基巯基酰胺基

3.带负电荷的R基氨基酸（酸性氨基酸，2种）这两种氨基酸都含有两个羧基，并且第二个羧基在pH7左右也完全解离，因此分子带负电荷。

4.带正电荷的R基氨基酸（碱性氨基酸，3种）胶原蛋白中的Lys侧链氧化时能形成很强的分子间(内)交联。Arg碱性很强，与NaOH相当。His是天然的缓冲剂，它往往存在于许多酶的活性中心。

（二）不常见的蛋白质氨基酸也称修饰氨基酸，是在蛋白质合成后，由基本氨基酸修饰而来。4-羟脯氨酸和5-羟赖氨酸，这两种氨基酸主要存在于结缔组织的纤维状蛋白中。（三）非蛋白质氨基酸不组成蛋白质，但有生理功能。（2）D-型氨基酸D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短杆菌肽S）（3）β-、γ-、δ-氨基酸β-Ala（泛素的前体）、γ-氨基丁酸（神经递质）。（一）氨基酸的解离氨基酸在晶体和水溶液中主要以兼性离子形式存在。氨基酸在两性离子时，氨基是以质子化(－NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(－COO-)存在。两性离子既有酸的作用，又有碱的作用。五、氨基酸的酸碱性质氨基酸的分部解离阳离子两性离子阴离子

正电荷负电荷PH>PIPH<PIPH>PI等电点（PI)正电荷负电荷（二）氨基酸的等电点等电点：当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态，少数离解成数目相等的阴、阳离子。pH=pI时，氨基酸净电荷为零；pH>pI时，氨基酸带负电荷，－COOH解离成－COO-，向正极移动；pH<pI时，氨基酸带正电荷，－NH2解离成－NH3+，向负极移动。

氨基酸的等电点可依其分子中氨基、羧基和R基的解离常数pKa值求出。解离常数(pKa)是水溶液中具有一定离解度的溶质的的极性参数。氨基酸等电点的计算公式可分为下列情况：1.非极性R基氨基酸和不带电荷的极性R基氨基酸（半胱氨酸除外）：pI=(pKa1+pKa2)/2

2.R基含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于兼性离子两边的pKa的算术平均值：

（1）酸性氨基酸：pI=(pKa1+pKR-COO-

)/2半胱氨酸（Cys)不属酸性氨基酸，但其—SH具有弱酸性，在PH7.0时，Cys的—SH大约解离8%，故其PI按酸性氨基酸计算。

（2）碱性氨基酸：pI=(pKa2+pKR-NH2)/2例1：计算天冬氨酸的等电点pI解：根据等电点的定义，近似求出pI=（pKa1+pKR)/2=(2.09+3.86)/2=2.97例2：Glu的pKa1＝2.19，pKa2＝9.67，pKR-COOH＝4.25，则等电点为?(3.22)（一）α-羧基参加的反应1.成酯反应羧基被醇酯化后，形成相应的酯。2.成酰氯反应羧基可与五氯化磷或二氯亚砜反应，生成酰氯，在多肽的人工合成中常用。3.成酰胺反应六、氨基酸的化学反应1.酰化反应

丹磺酰氯（5—二甲基氨基萘-1-磺酰氯，DNS-Cl）：常用于多肽链－NH2末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定。（二）α-NH2参加的反应

NGly—Ala—Ser—Leu—PheC

DNS—Gly—Ala—Ser—Leu—PheC水解产物：DNS—Gly、Ala、Ser、Leu、PheDNS-AA在紫外光激发后发黄色荧光。DNS

2.烃基化反应

α-氨基中的氮是一个亲核中心，能与烃基（包括环烃及其衍生物）发生亲核取代反应，如Edman反应（可鉴定多肽的NH2末端氨基酸）。Edman反应(苯异硫氰酸酯，PITC)产物：苯乙内酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸），无色，可以用层析法分离鉴定。被Edman用来鉴定多肽的NH2末端氨基酸。（三）茚三酮反应与茚三酮反应（★）茚三酮在弱酸中与α-氨基酸共热，引起氨基酸的氧化脱氨、脱羧反应，最后，茚三酮与反应产物——氨和还原茚三酮反应，生成紫色物质。氨基酸与茚三酮的反应过程用纸层析和柱层析把各种氨基酸分开后，用茚三酮显色可以定性鉴定，并在570nm定量测定各种氨基酸。Pro、Hy-Pro与茚三酮直接形成黄色化合物。（四）

侧链官能团的特异反应—用于蛋白质的化学修饰氨基酸侧链含有羟基、酚基、巯基、吲哚基、咪唑基、胍基、甲硫基等。蛋白质的化学修饰：在温和条件下，以可控制的方式使蛋白质与某种试剂发生特异反应，引起蛋白质中个别氨基酸侧链或功能团发生共价化学改变。

Cys(－SH)卤化烷（碘乙酸等）：保护巯基，防止重新被氧化；2—硝基苯甲酸：分光光度法定量测定巯基；易被氧化成胱氨酸胱氨酸的氧化（产物：磺基丙氨酸。氧化剂：过甲酸）胱氨酸的还原（产物：半胱氨酸。还原剂：巯基乙醇等）七、氨基酸的旋光性和光谱性质（一）氨基酸的旋光性和立体化学1.氨基酸的构型氨基酸构型：L型、D型。除了苏、异亮有四种光学异构体,甘氨酸只为L型外，其余17种氨基酸有两种光学异构体：L型、D型。构成蛋白质的氨基酸均属L-型。外消旋物：D-型和L-型的等摩尔混合物。L-苏和D-苏组成消旋物；L-别-苏和D-别-苏组成消旋物。2.氨基酸的旋光性氨基酸的旋光性（符号和大小）取决于它的R基的性质，并与溶液的pH值有关。比旋是α－氨基酸的物理常数之一，蛋白质中L型氨基酸的比旋光度见表2-3。Gly无手性C，无旋光性;

H2N—Cα—HCOOHH（二)氨基酸的光谱性质氨基酸的光吸收性20种基本氨基酸在可见光区都没有光吸收，在红外区和远紫外区有光吸收。在近紫外区（200-400nm）只有芳香族氨基酸（Tyr、Phe、Trp的R基含有共轭双键）有光吸收。λ（nm）εTyr2751.4×103Phe2572.0×102Trp2805.6×103

蛋白质在280nm有最大紫外吸收光吸收，分光光度法鉴定。核磁共振（NMR）：在aa和Pro化学表征方面起重要作用。知识链接核磁共振(NMR)是电磁波（无线电波）与原子核自旋相互作用的一种基本物理现象。NMR波谱学具有最高的频率分辨率。NMR曾经使物理学家为之神魂颠倒，近二十年来越来越多的化学家、生物学家和医学家也涉足其中。目前生物NMR波谱学研究的前沿领域包括：1.生物分子三维结构的NMR测定方法和应用2.生物分子相互作用、动力学及其与功能的关系研究方法和应用3.基于NMR的代谢组学研究方法和应用4.生物组织的高分辨NMR分析方法和应用中国科学技术大学生命科学学院核磁共振波谱实验室：主要用多维核磁共振波谱及计算生物学研究与重大疾病或重要生理功能相关的蛋白质结构,动力学与功能关系,以及蛋白质相互作用。蛋白质因含有这些氨基酸，所以也有紫外吸收能力，一般在280nm波长处有最大光吸收，因此能利用紫外吸收法鉴定并测定样品中蛋白质的含量。分配原理固定相和流动相；混合物在层析系统中的分离决定于该混合物组分在两相中的分配情况；分配系数；固—液、液—液、气—液；（一）分配层析法：

分配系数Kd=CACBCA：一种物质在A相（流动相）中的浓度

CB：一种物质在B相（固定相）中的浓度八、氨基酸混合物的分离和分析原理：主要根据被分析的样品（如aa混合物）在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的目的。固定相和流动相基于分配系数差异的分离方法—分配层析1.柱层析2.纸层析3.薄层层析1、柱层析

层析柱中的填充剂或支持剂表面附着一层结合水作为固定相，沿固定相流过的与它互不相溶的溶剂是流动相。当用洗脱剂洗脱时，柱上端的氨基酸混合物在两相之间会按不同的分配系数以不同的速度向下移动。分部收集层析柱下端的洗脱液，然后分别用茚三酮显色定量，以氨基酸量对洗脱液体积作图得洗脱曲线，曲线中的每个峰相当于某一种氨基酸。加洗脱剂氨基酸样品支持剂层析柱分部收集1.00.50.1光吸收值

20406080100120流出液（毫升）2、纸层析

固定相：滤纸纤维素上吸附的水流动相：展层用的溶剂层析时，混合氨基酸在这两相中不断分配，使它们分布在滤纸的不同位置上。基本步骤：点样、展层、显色、定性（定量）层析时，将样品点在滤纸的一个角上，称为原点。然后将其放入一个密闭的容器中，用一种溶剂系统进行展层，层析后烘干滤纸，再将其旋转90度采用第二种溶剂系统进行第二相展层。由于各种氨基