第2章细胞培养技术与应用-2

六、水产经济动物的细胞培养进展脊椎动物无脊椎动物鱼类多孔动物门棘皮动物门腔肠动物门节肢动物门软体动物门1、鱼类鱼类细胞原代培养所取材的组织器官来源很多，包括性腺、肾脏、肝脏、脾脏、心脏、鳍条、鳔、鳃上皮、皮肤、吻端、内分泌组织、血液、肌肉组织以及骨骼细胞。鱼类胚胎和幼鱼的各种组织，分化程度低，分裂潜能大，病毒携带少，适合作为原代培养的材料。鱼类细胞平均传代100代仍可以继续分裂,比起哺乳类,分裂极限要大得多,并且每一代细胞的存活期均较长;人和哺乳动物离体培养的正常二倍体细胞株寿命一般不超过50代。至2010年,建立的鱼类细胞系约有275类，其中大多数来自淡水鱼或溯河产卵的海洋鱼类，约175株，分别来源于71个科的89种鱼类的不同组织；而海水鱼类及咸水鱼类的细胞系约100株，分别来源于23个科的35种海水鱼类的不同组织。1981年我国建立了最早的鱼类细胞系——草鱼吻端组织细胞系，至今已经建立了70余种细胞株（系），来自40多种鱼类。来源的组织有吻端、肾脏、卵巢、尾鳍、膘、性腺、肝脏、胚胎、囊胚、原肠胚、鳍条等。以淡水鱼细胞培养为主。海水鱼细胞的培养也越来越受到重视，如牙鲆鳃细胞系、鲈鱼脾和心细胞系、真鲷鳍细胞系、花鲈胚胎干细胞系、漠斑牙鲆胚胎干细胞系、大菱鲆鳍细胞系、点带石斑鱼脾脏细胞系等。1976年建立了世界上第一个鱼类细胞系，虹鳟鱼生殖腺细胞系：RTG-2。鱼类细胞系的应用越来越广泛,已由单纯的病毒培养分离、免疫学、毒理学、致癌作用、遗传学研究逐步向近些年研究很集中的基因组学、DNA的复制与修饰、表观遗传学、基因敲除、RNAi以及最新的iPS等各个方面发展。2、节肢动物已经对龙虾、中国对虾、日本对虾、草虾、斑节对虾、罗氏沼虾等多种虾类进行了细胞培养研究。但由于其生理、生化特点以及生活环境均与陆生动物有很大差异，加之其细胞的营养需要和代谢机理研究滞后，因而，节肢动物细胞系的建立问题至今仍是全世界所面临的挑战性课题。斑节对虾淋巴器官的细胞在L-15培养基中传了90代，第90代后细胞不能继续传代生长，只建立了有限细胞系。心脏、卵巢、鳃、胸腺、内脏、肌肉、淋巴、肝胰脏等组织以及胚胎都被尝试培养过。最易培养的组织依次是心脏、淋巴、卵巢、脑神经节、眼球。待培养组织的消毒灭菌非常困难。节肢动物的组织器官大多暴露于外界,带有较多的微生物和寄生虫,即使是健康个体体内也存在一些微生物,使得培养易受污染而失败。虽然虾的胚胎和幼体应是最易培养的材料,但是其胚胎和幼体是体外发育,受微生物污染严重,目前还没有理想的消毒方法。鲎的鳃组织暴露在海水中，附有一层粘液，冲洗液很难除菌，鲎的血液中生活有许多的原生动物，在培养鲎血细胞时，经常出现原生动物污染的现象。虾类细胞培养的应用——病毒研究：杆状病毒(MBV)、黄头病毒(YHV）、白斑综合症病毒(WSSV)、皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV）、虾弹状病毒奇怪的现象：虾蟹类在春季、秋季细胞培养较难，冬季几乎不能成功。这可能与其体内的激素分泌和细胞的基因调控有关。软体动物的数量仅次于节肢动物,为动物界中第二大类群,包括各种螺类、双壳类、乌贼和章鱼等。软体动物是细胞培养研究开展得最多的一类海洋无脊椎动物。3、软体动物门软体动物细胞培养的对象主要是一些养殖的双壳类和腹足类,包括贻贝、珍珠贝、牡蛎、蛤蜊、螺和鲍等。所培养的组织细胞主要来源于胚胎、鳃、外套膜、神经细胞、血细胞、消化腺和心肌等。19世纪70年代,软体动物细胞培养就已取得了一些进展。在珍珠牡蛎外套膜组织培养中,成功观察到了体外培养的外套膜细胞能够分泌有机物和进行有丝分裂的现象。但随后的珍珠牡蛎的外套膜组织培养却一直没有很大的进展。1976年,建立起了第一个也是迄今为止唯一一个软体动物细胞系:淡水蜗牛担轮幼虫胚胎细胞系BGE。至今没有解决海洋软体动物细胞的体外长期存活和成功传代建系的问题,即使是培养贝类的肿瘤组织也不例外。近年来,海洋软体动物原代细胞培养物的应用研究开始增多。利用巨牡蛎的血细胞凝集实验来检测外源污染物的毒性效应。贝类细胞培养Ⅱ：无脊椎动物缺少获得性免疫系统，血液是重要的免疫器官。细胞培养作为良好的体外实验模型非常适用于血细胞对外毒物的反应的研究Ⅰ：外套膜细胞培养。主要有：马氏珠母贝、栉孔扇贝、鲍、文蛤、大珠母贝Ⅲ：鳃细胞的培养。①利用原代培养的栉孔扇贝血细胞探究了血细胞在细菌脂多糖的刺激下免疫相关基因CfToll-1表达量的变化情况；研究苯并芘对栉孔扇贝血细胞的影响。②利用多种病原相关分子模式刺激培养的长牡蛎原代血细胞来研究相关基因表达随时间的变化情况。③利用僧帽牡蛎的鳃组织进行了培养，并在此基础上研究了毒性较大的氯化三丁基锡对牡蛎鳃组织细胞的细胞形态以及存活率的影响。贝类细胞培养面临的主要困难（2）在添加促生长因子方面，一直没能寻得一种或是几种混合的生长因子来促进贝类细胞的生长繁殖。不能单纯的套用哺乳动物细胞培养模式，必须要充分的认识海洋贝类动物的不同，深入研究贝类细胞的营养代谢以及细胞生理等，以便研发海洋贝类细胞培养所适用的培养基；（3）贝类开放的生活环境，器官组织携带大量病菌。（1）在体外使贝类细胞无限增殖仍然是全世界所面临的难题。目前对于海洋无脊椎动物特别是贝类细胞增殖和调控的知识知之甚少；由于海绵特殊的细胞结构和生理特点,使得海绵细胞培养面临很大困难,进展缓慢,仍停留在原代培养水平。主要有以下两个原因:(1)海绵动物多为合胞体，即整个生物体是由一个巨大的内有横隔片的多核细胞构成，通过胞内隔片上的孔道来进行细胞内的物质交换。分散培养的细胞在体外培养中很难存活和分裂。体外培养的海绵细胞相互接触后,会彼此融合,形成一个大的多核体,结构与体内有着很大的不同；2)海绵动物体内存在着多种内共生的微生物,难以实现海绵细胞的无菌培养。如果不使用抗生素的话,培养又只能维持1~3天。4、多孔动物（海绵动物）细胞分散技术对存活细胞的数量、组织培养的好坏和培养时间的长短都有很大影响。体外培养腔肠动物细胞的存活、贴壁和迁移对培养基质有着很严格的要求。在培养时,多数腔肠动物细胞都只有与细胞外基质相接触时才能存活,而且它们只有附着于由中胶层残片构成的基质上,才能很好地贴壁、铺展和迁移。腔肠动物门包括珊瑚、海葵等,是二胚层多细胞后生动物,有了组织的分化,但结构简单,体壁仅由内、外胚层两层细胞以及中间无细胞结构的中胶层构成,细胞类型少。5、腔肠动物细胞分散技术对存活细胞的数量、组织培养的好坏和培养时间的长短都有很大影响。体外培养腔肠动物细胞的存活、贴壁和迁移对培养基质有着很严格的要求。在培养时,多数腔肠动物细胞都只有与细胞外基质相接触时才能存活,而且它们只有附着于由中胶层残片构成的基质上,才能很好地贴壁、铺展和迁移。腔肠动物门包括珊瑚、海葵等,是二胚层多细胞后生动物,有了组织的分化,但结构简单,体壁仅由内、外胚层两层细胞以及中间无细胞结构的中胶层构成,细胞类型少。5、腔肠动物水螅剖面图棘皮动物的细胞培养研究开展得很少,虽然棘皮动物具有无与伦比的再生能力,如海星臂的再生和海参的吐脏再生等。但是其细胞培养还是难获成功,目前仍然停留在原代培养的水平上。6、棘皮动物海参吐脏最早在1993年开始了对海参再生组织的细胞培养,至40天时,观察到再生肠组织来源的细胞团发生旋转和再生呼吸树来源的细胞团出现搏动现象。最近,对海参吐脏后不同再生阶段的肠组织进行了原代培养,发现只有吐脏后第14～16天的再生肠组织的原代培养物中,能观察到活跃的细胞增殖,细胞的数量于培养后第20天加倍,而在其他再生阶段的肠组织原代培养物中均未观察到细胞分裂现象。第五节

细胞培养技术的应用应用1用细胞生产珍珠珍珠的价值中国海水珍珠年产量20余吨；淡水珠产量1500余吨,占世界的95％以上,但能作为高档工艺珠的不足1%。与生产工艺有关年需求量约1000吨，出口量达400吨

观赏收藏药用保健药用珍珠珍珠粉为类白色的极细粉，气微，味淡。4%4%91%0.4%牛磺酸维生素药用、化妆品、中成药的主要原料（六神丸、安宫牛黄丸等），安神、平肝息风。天然海水珍珠淡水养珠蚌科

三角帆蚌

（珠质细腻、光滑、色泽鲜艳、较圆，质量最佳，但成珠慢）

褶纹冠蚌

（珍珠长圆形，白色或粉红色；成珠快，产量高）

珍珠的主要来源珍珠贝科

马氏珍珠贝，又称南珠，粒大、圆润、光彩迷人,为国之瑰宝）马氏珍珠贝又称合浦珠母贝。贝壳斜四方形，背缘略平直，腹缘弧形，前、后缘弓状。前耳突出，近三角形；后耳较粗短。中国分布在广西、广东和台湾海峡南部沿海一带。国际上公认中国出产的南海珍珠的质量在世界上首屈一指。珍珠的形成机理软体动物和腕足动物壳内的体壁褶。珍珠的形成机理珍珠的形成机理外套膜海水珍珠养殖场传统的珍珠生产超大型淡水珍珠养殖吊养场采收珍珠视频资料利用细胞培养技术生产珍珠目的：培养直径8mm以上、光泽度好的正圆珍珠实验材料：（1）选取体质健康、大小均一的1龄三角帆蚌用作细胞培养，3龄的三角帆蚌为插核之用。（2）细胞培养材料：RPMI1640培养基、胎牛血清、0.25％胰酶、10000IU双抗(青、链霉素)、牛磺酸、抗坏血酸、水解乳蛋白、制霉菌素、多聚赖氨酸（1）外套膜上皮细胞培养生产实现的过程（2）细胞活性与贴壁效果的检测（3）珠核的预处理台盼蓝染色法显微镜观察法1龄小蚌，切断前后闭壳肌，撕膜法分离出外套膜外表皮，剪碎，胰酶消化洗涤、高压灭菌处理（5）内脏团插核手术（为什么选择？）（6）垂直吊养（4）共培养严格消毒后，用通道针在内脏团与斧足交界处开口，并制造通道，深度为2cm，口径为1cm，将处理后的珠核移植到育珠蚌体内，吸取0.5mL外套膜细胞悬液，注射到珠核周围。用浸泡在双抗中的一次性棉棒擦拭伤口，按压以促进伤口消炎愈合。珠核放入培养基培养的细胞悬液中，完全淹没珠核。吊养位置为水面下25cm处，进行常规育珠养殖。由于外套膜比较薄，容易插破，不适宜插大核来培育大颗粒的珍珠。相比之下内脏团分布空间很大，且具有珍珠生物矿化所需的生化条件。应用2鱼类病毒学

用细胞分离、检测鉴别病毒什么是病毒？视频资料病毒对水产养殖的危害迄今已发现的近60种鱼类病毒。其中有9种病毒对渔业生产有严重的影响,它们是:①双RNA病毒科的传染性胰坏死病毒②虹彩病毒科的虹彩病毒③棒状病毒科的双链DNA棒状病毒④呼肠病毒科的草鱼呼肠病毒⑤野田病毒科的野田病毒⑥弹状病毒科的鲤鱼春季病毒血症病毒、病毒性出血性败血症病毒、传染性造血器官坏死病毒和白斑狗鱼幼鱼弹状病毒。传染性胰坏死病毒：10～12℃死亡率可高达80～100%。胰腺坏死，胰腺泡、胰岛及所有的细胞几乎都发生异常，多数细胞坏死，核固缩、核碎裂十分显著。病鱼游动失调，常作垂直回转游动，不久便沉入水底，伺歇片刻后又重复以上游动，直至死亡。虹彩病毒：死亡率从30%(成鱼阶段)到100%(幼苗阶段)不等。感染的硬骨鱼类包括鲈形目、鲽形目、鳕形目和鲀形目等4目近百种海水、淡水鱼类。出血性败血症病毒：许多鲑鳟鱼对其敏感。传染性强，死亡率可达80%。有急性型(体黑、眼突出，肌肉、脂肪组织、口腔和鳔出血，死亡率高，常见初期)、慢性型(动作迟缓，贫血，低死亡率，常见中期)和神经型(运动失调，螺旋状旋转游动，缓慢死亡，流行末期)3种类型目前无有效治疗方法。病毒感染环境因素免疫系统虾类病毒：杆状病毒(MBV)、黄头病毒(YHV）、白斑综合症病毒(WSSV)、皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV）、虾弹状病毒。在体外原代培养的斑节对虾类淋巴细胞中进行了斑节对虾杆状病毒(MBV)、白斑综合症病毒(WSSV)和黄头病毒的增殖,获得成功。用凡纳滨对虾类淋巴原代细胞接种黄头病毒(YHV),出现了CPE。致细胞病变效应（cytopathiceffect，CPE）：指病毒在宿主细胞内大量增殖，导致细胞病变甚至死亡的现象。具体而言，体外组织细胞培养时，溶细胞病毒在易感细胞内大量复制增殖导致细胞死亡或细胞出现变圆、脱落、聚集等现象，称为致细胞病变效应。致细胞病变效应细胞培养分离病毒斜带石斑鱼的脑组织细胞系GBC1和GBC4并用于病毒敏感性实验,发现前者对于神经坏死病毒(GNNV)高度敏感,但对于花鲈虹彩病毒(GSIV)不敏感而后者的结果正好相反。玳瑁石斑鱼脑、鳃、心脏3个细胞系,进行了病毒及细胞毒素敏感性的实验,发现3种细胞系对于不同病毒和毒素的敏感性存在明显的差异。病毒对细胞具有选择性病毒的培养分离实例-----鱼源弹状病毒的分离鱼类弹状病毒是一类能使多种鱼出现高致死率的病毒病原体，其感染宿主谱广、普遍存在、严重危害各种淡水和海水鱼。迄今报道感染鱼类的弹状病毒已有20多种，包括导致鲤科鱼类大规模爆发鲤春病毒血症的鲤春病毒血症病毒、引起虹鳟、鲑等患出血性疾病的病毒性出血性败血症病毒、引起鳟鱼和太平洋大马哈鱼为主的急性、全身性的严重传染病的传染性造血器官坏死病毒、以及牙鲆弹状病毒、乌鳢弹状病毒、鳜鱼弹状病毒、胭脂鱼弹状病毒、石鲽鱼弹状病毒等。草鱼肾细胞系(CIK)肥头鲤细胞系(FHM)鲤上皮细胞系(EPC)草鱼脑细胞(CIB)草鱼鳔细胞(GSB)锦鲤吻端细胞系(KPC)剑尾鱼胚胎细胞系(SFC)鳜脑细胞系(SCC)所用细胞系及代号无菌采取病鱼的鳔、肝、肾、脾，加入含双抗的灭菌的PBS中制成1∶1的匀浆液，在－20℃冻融3次后，组织匀浆液依次经2000、5000和10000r/min，每次离心10min，去沉淀，上清液经滤膜孔径为0.22μm的微孔滤器过滤除菌分别接种密度为80%~90%的单层FHM、EPC、CIK、GIB、GSB、KPC、SFC和SCC细胞，室温下吸附1h，吸弃病毒液，加入与培养液等量的维持液(含3%FBS的M199)，28℃恒温培养，每日观察细胞形态。病毒传代时，将病毒细胞培养物反复冻融2～3次。如何检测鉴别病毒？直接检测免疫检测分子生物学检测1、电子显微镜；2、病毒包涵体检查1、酶免疫技术；2、荧光免疫技术3、单克隆抗体技术1、核酸杂交；2、PCR、RT-PCR技术；一、电子显微镜检测技术研究病毒形态、鉴定诊断病毒病

检测不能在体外培养的病毒，如轮状病毒、星状病毒、嵌杯病毒、HAV等都是用电镜最先发现的——能进一步发现新的病毒和病毒病。弹状病毒的电子显微镜观察标本的制备浓缩标本方法：①超速离心离心的时间和速度取决于病毒颗粒的大小和离心机转头的半径，一般是30min到3h．沉淀的样本用灭菌蒸馏水洗后再放到铜网上；②超过滤法用于分子筛的蛋白质相对分子质量为10000；③接种细胞接种细胞增殖病毒，然后快速包埋、切片；④免疫凝集如有特异抗血清，且病毒已知，也可用该法浓缩病毒1、正染法（超薄切片法、病组织）将细胞用戊二醛固定，然后脱水、包埋、切片、染色、观察病毒颗粒，通常1~2d完成。操作复杂、费时，但样品可长期保存，可观察病毒粒子形态与发生过程。2、负染法直接将病毒悬液(也可用细胞)滴在铜网上，用重金属(通常用磷钨酸)进行染色，观察病毒颗粒，10-20min可出结果。原理：负性染料不渗入病毒颗粒，而是将病毒颗粒包绕，由于负性染料含重金属使电子束不能穿透，病毒颗粒具有亮度，在周围暗背景上显示亮区——较正染法显示的图像清晰，可显示病毒的结构。缺点：敏感性低，要求病毒量在107／mL以上，同科病毒难于鉴别。3、投影技术采用几种电镜技术观察病毒粒子的形态Orfvirus：口疮病毒(接触性脓疱皮炎)Ebolavirus埃博拉病毒（正染技术）Vacciniavirus痘苗病毒（投影技术）负染技术彩色电子显微照片。它显示出H5N1型禽流感病毒（金黄色）在MDCK细胞（绿色）培养液中的活动状态二、病毒的免疫检测1、荧光免疫法(IF)2、酶免疫法（ELISA）3、单克隆抗体技术1、免疫荧光法(IF)荧光（fluorescence）荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。

荧光寿命定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。各种荧光物质的荧光寿命不同。

荧光物质最大吸收光谱最大发射光谱应用异硫氰酸荧光素(FITC)490～495nm520～530nm（黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定四乙基罗丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)550nm620nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT藻红蛋白（PE）490-560nm595nm（红色）双标记FAT、流式细胞术7-氨基-4-甲基香豆素354nm430nm（蓝色）双标记或多标记FATEu3+螯合物340nm613nm时间分辨荧光免疫测定荧光物质：一类能吸收激发光的光能而发射荧光的物质。

电子的跃迁荧光抗体技术的基本原理

荧光素标记抗体与切片中组织细胞抗原反应，洗涤分离后荧光显微镜观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其部位，对组织细胞抗原进行定性和定位检测，或对自身抗体进行定性和滴度测定。抗体要求

高特异性高亲和力经纯化提取IgG

荧光抗体的制备有能与蛋白质形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。结合后，仍保持较高的荧光效率。荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。标记方法简单、安全无毒。与蛋白质的结合物稳定，易于保存。荧光素要求抗体的荧光素标记标记原理:利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。标记方法:

搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间短，荧光素用量少，但有非特异性染色。

透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀，非特异染色较低。去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收荧光抗体的纯化直接法直接荧光抗体染色法示意图荧光素标记的特异性抗体直接与相应抗原反应。荧光抗体染色间接法特异性抗体与相应抗原反应，荧光素标记的抗抗体再与第一抗体结合。

间接荧光抗体染色法示意图荧光显微镜利用一定波长的激发光对样品进行激发，产生一定波长的荧光，对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。

主要试剂:

酶标记的抗体或抗原酶标物特点：

免疫学活性酶对底物的催化活性抗原抗体反应的特异性+酶促催化反应的高敏感性2、酶免疫法（ELISA）特点：灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染。易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。原理：酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析

酶免疫技术的核心部分

酶结合物（conjugate）酶标记物通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的结合物

酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均相异相固相酶免疫测定液相酶免疫测定组织切片中的抗原抗体反应

液体标本中抗原或抗体的定性和定量(ELISA)三个部分：免疫反应酶与底物反应检测方法的建立ELISA酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）高纯度的抗原、高亲和力的抗体高活性、高纯度的标记用酶有效的交联方法制备高质量的酶标记物选用适宜的酶/底物系统底物显色定性或定量的分析原理包被反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离1234固相的抗原或抗体

酶标记物

酶反应的底物

双抗体夹心法（doubleantibodysandwich-ELISA）方法：用已知抗体包被，加入待检血清病毒样品，再加酶标抗体，加底物显色应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定(乙型肝炎表面抗原HBsAg),不能用于半抗原等小分子的测定。ELISA检测抗原的方法1、已知抗体包3、加酶标抗体4、加酶作用的底物2、加待检物4、加酶作用的底物洗涤洗涤洗涤洗涤双抗体夹心法测抗原1、已知抗体包2、加待检物无抗3、加酶标抗体+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY阴性对照洗涤洗涤洗涤洗涤捕获法+-EYEYEYEYEYYYYYYY

1、固相化抗人IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人IgM2、加待测物特异性IgM与非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，与特异性抗体结合4、加酶标抗体与特异性抗原结合，加底物显色2、加待测物只有非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，不能与非特异性IgM结合4、加酶标抗体无抗原结合，加底物不显色（一）固相载体聚苯乙烯特点：吸附蛋白能力强，保留其免疫活性形状：小试管、小珠、微量ELISA板

（二）抗原和抗体高纯度的抗原高效价的抗体固相酶免疫测定的技术要点

（三）酶和底物的选择标记酶的要求：

活性高性质稳定专一性强酶催化底物的显色信号易于判断和测量方法敏感，重复性好，简单易行酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉辣根过氧化物酶(HRP)糖蛋白HRP的常见底物

邻苯二胺OPD四甲基联苯胺TMB5-氨基水杨酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐ABTSOPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。碱性磷酸酶（ALP）菌源性ALP肠粘膜ALPβ-半乳糖苷酶（β-Gal）其他的酶大肠埃希氏菌

ALP的底物

对-硝基苯磷酸酯（pNPP）经ALP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。

β-Gal的底物

4-甲基伞酮基β-D-半乳糖苷（4MUG）酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计测量。抗原要求纯度高，抗原性完整抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。

酶标抗体制备方法要求制备方法过碘酸钠法（直接法）常用于HRP标记抗体或抗原

戊二醛交联法酶标记物质量较均一纯化标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度

抗体是从何来的？传统的抗体生产方法及缺陷是什么？

抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。3、单克隆抗体技术

（１）B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。（２）动物体内的B淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。（３）每一个淋巴细胞只能产生一种抗体。B淋巴细胞有什么特点？单克隆抗体的特点？

由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。

特异性强、灵敏度高

单克隆抗体制备过程？1、单克隆抗体：2、特点：单克隆抗体制备过程

注射抗原B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选杂交瘤细胞细胞培养筛选，继续培养足够数量的、能产生特定抗体的细胞群体外培养注射到小鼠腹腔单克隆抗体单克隆抗体的应用1、诊断试剂（病原微生物、肿瘤抗原检测）2、蛋白质提纯3、肿瘤导向治疗技术（生物导弹）动物细胞融合技术

细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合

受精作用诱导细胞融合的方法用

诱导动物细胞融合过程细胞核病毒颗粒灭活的病毒细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜连接杂种细胞融合细胞的筛选方法常用的克隆化培养方法1、半固体平板培养法2、有限稀释法3、显微镜操作法4、盖片分离法有限稀释法样品处理富集获得病毒的核酸序列是描述病毒特征的关键。检测分子生物学方法三、病毒的分子生物学检测1、核酸杂交技术2、PCR和RT-PCR技术同源性：从分子水平讲则是指两个核酸分子的核苷酸序列间的相似程度。1、核酸杂交技术DNA的变性与复性DNA变性：DNA双链之间以氢键连接，氢键是一种次级键，能量较低，易受破坏，在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散，变成单链，即为DNA变性。DNA复性：变性DNA在适当条件下，两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象，这种现象称为复性。核酸杂交：DNA单链之间、RNA单链之间、一条DNA和一条RNA链之间只要存在序列互补配对区域，不管是整条链互补，还是部分序列互补，即可重新形成整条双链或部分双链，即为核酸分子杂交。琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其等电点为pH=2-2.5，在常规的电泳缓冲液中（pH约8.5），核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。琼脂糖凝胶电泳原理琼脂糖凝胶电泳核酸分子的迁移率由下列几种因素决定：（1）DNA的分子大小。线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢。（2）DNA分子的构象。相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的，超螺旋DNA移动得最快，而开环状DNA移动最慢。（3）电压。在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。（4）离子强度影响。电泳缓冲液的组成及离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水），电导率最小，DNA几乎不移动；在高离子强度，则电导率很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。溴化乙锭(Ethidiumbromide,EB)能插入DNA分子中形成复合物，在波长为254nm紫外光照射下EB能发射荧光，而且荧光的强度正比于核酸的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估算出待测样品的浓度。Southern印迹杂交

使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由英国人EdwinMellorSouthern于1975年首先设计出来的，故又叫Southernblot。Southern杂交的主要步骤（a）（b）（c）（d）（e）基因组DNADNA限制片段硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因DNA片段X光底片待测DNA样品的制备、酶切待测DNA样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳凝胶中DNA的变性：碱变性Southern转膜：硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法探针的制备Southern杂交杂交结果的检测SouthernDNA印迹杂交之X光显像图片利用非放射性探针检测核苷酸Northern杂交*1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。也称为Northern印迹（NorthernBlot），用以检测某一特定的RNA（通常是mRNA）片段的存在及表达量。*因这种方法与Southernblot杂交技术十分类似，与DNA的杂交（Southern杂交）相对应，被趣称为Northern杂交。Northern印迹杂交1、基本原理和基本过程与Southernblot基本相同2、鉴别RNA3、探针可用DNA或RNA片段4、待测样品为总RNA或mRNANorthern印迹与Southern印迹的不同点1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂(甲醛、尿素、甲酰胺等)保持RNA处于变性状态。避免单链RNA自身形成高级结构和自身降解

2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理。原位杂交*细胞或染色体的原位杂交，用于基因定位。将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA杂交。特点能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态原位杂交过程：（1）组织或细胞的固定（2）组织细胞杂交前的预处理（3）探针的选择与标记探针的长度一般为50~300bp

（4）杂交杂交温度约为50℃（5）杂交结果检测病毒性神经坏死病毒病(viralnervousnecrosis,VNN)是石斑鱼育苗过程的重大病害之一,该病原体为二十面体,无囊膜,直径25~30nm的RNA病毒,属于诺达病毒科。发病症状为鱼不正常游动,鱼鳔胀气肿大,体色变深,厌食,可导致鱼苗的大量死亡。致病性很强,对石斑鱼的养殖影响严重,一旦爆发,难以控制。人工感染组织切片核酸探针的制备染色和原位杂交检测用标记有地高辛的426bp的病毒核酸片段与组织切片上病毒RNA进行杂交。杂交阳性物质为紫褐色颗粒。BCIP/NBT紫蓝色沉淀Dig（地高辛）抗Dig抗体碱性磷酸酶核酸分子杂交原理示意图常用探针类型

①人工合成寡核苷酸探针②基因组DNA探针③cDNA探针④RNA探针探针标记物①放射性标记物

32P高放射性半衰期14.3d

35S放射性较弱半衰期87.1d

3H放射性弱半衰期12.35a②非放射性标记物

半抗原：生物素、地高率配体：生物素是亲和素的配体荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等化学发光探针：标记物与某种底物反应发光，如生物素酰化的碱性磷酸酶可使发光底物发光

理想探针标记物应具备的特性

高度灵敏性不影响碱基配对的特异性不影响探针分子的主要理化性质对酶促反应活性无影响或影响不大检测方法具有高度灵敏性和高度特异性2、PCR技术聚合酶链式反应（PCR）是目前比较快速、敏感、特异的检测手段，已被广泛应用在病毒核酸检测方面。

DNA的复制方向

PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环。通过多次循环反应，使目的DNA序列得以迅速扩增。PCR的原理PCR步骤：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93～94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合；耐热的DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。如此循环进行，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。PCR的结果---电泳图反转录-聚合酶链式反应RT-PCR

RT-PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，它是以RNA为模板，根据碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA。这一过程与一般遗传信息流转录的方向相反，故称为反转录，催化此过程的DNA聚合酶叫做反转录酶。基本过程是以dNTP为底物，以RNA为模板，按5’→3’方向，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA(cDNA)，它与RNA模板形成RNA-DNA杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，完成由RNA指导的DNA合成，然后将DNA进行PCR扩增。应用3疫苗的制备免疫系统与免疫应答（一）抗原凡能刺激机体免疫系统，使之产生抗体或致敏免疫活性细胞（淋巴细胞），并能与之发生特异性结合的物质统称“抗原”。具有上述2种特性的物质称为完全抗原。（二）抗体抗体是由抗原刺激机体免疫系统后产生，并能与相应抗原发生特异性结合的物质。T淋巴细胞T淋巴细胞是胸腺依赖性淋巴细胞的简称。由骨髓中多功能干细胞发育分化，并成熟于胸腺。它是一个复杂的群体，分为不同亚群。各亚群在形态学上并无明显标记，但不同亚群淋巴细胞分泌不同细胞因子。B淋巴细胞B淋巴细胞在骨髓中分化成熟，故又称为骨髓衍生细胞。B淋巴细胞在接受到APC传递的抗原信息后，在Th和巨噬细胞分泌的细胞因子作用下，使B淋巴细胞活化，分化为成熟的浆细胞产生抗体，1个浆细胞每秒钟能够分泌超过2000个抗体分子。抗原免疫应答什么是疫苗？疫苗是将病原微生物如细菌、病毒等及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或转基因等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。疫苗刺激机体免疫系统对某种病原微生物处于高度戒备状态疫苗的发展历史

①古典疫苗时期：牛痘苗、狂犬病疫苗

②培养疫苗时期：脊髓灰质炎疫苗、卡介苗

③基因工程疫苗时期：乙型肝炎基因工程疫苗疫苗的种类灭活疫苗弱毒疫苗基因工程疫苗重组亚单位疫苗DNA疫苗基因缺失疫苗基因突变疫苗活载体疫苗传统疫苗成本低、无致病性、适用广

灭活疫苗（inactivatedvaccine）：又称死疫苗，是用化学或物理的方法，将具有感染性的完整的病原微生物杀死，使其失去传染性而保留抗原性而成。

一、灭活疫苗百日咳、乙型脑炎、流行性脑脊髓膜炎、狂犬病、伤寒、钩体病、甲型肝炎、鼠疫、流感、脊髓灰质炎等疫苗。二、减毒活疫苗（弱毒疫苗）减毒活疫苗（live-attenuatedvaccine）：用人工诱变或从自然界筛选出的毒力高度降低或无毒的活的病原微生物制成的疫苗。可模拟自然发生隐性感染，诱发理想的免疫应答而又不产生临床症状。

脊髓灰质炎、结核病、麻疹、风疹疫苗、腮腺炎等疫苗。

●优点：能诱发全面、稳定、持久的体液、细胞和粘膜免疫应答；一般只须接种一次；可采用口服、喷鼻或气雾途径免疫。

●缺点：有效期短和热稳定性差，运输、保存条件要求较高；回复突变危险；使用范围相对窄。

减毒活疫苗优缺点1、基因缺失活疫苗（genedeletedlivevaccine）：采用分子生物学技术，去除与毒力或毒力相关基因片段，使病原微生物毒力减低或丧失。用缺失突变毒株制成的疫苗。与自然突变株（多为点突变毒株）相比，基因缺失活疫苗具有突变性状明确、稳定、不易发生毒力返祖的优点。

三、基因工程疫苗对于某些抗原性弱、易发生免疫逃避的病原体，常规疫苗往往难以获得有效的免疫应答及保护性。2、亚单位疫苗对于一些免疫保护机制不清、可能诱导免疫病理反应、有潜在致肿瘤作用的病毒，以及不易培养的病原体，则难以用传统方法生产疫苗。

亚单位疫苗：亚单位疫苗是应用某些化学试剂裂解细菌或病毒,驱除病原微生物中有害成分和无用的成分,保留其中一种或几种主要抗原成分的一类疫苗。不含病原体核酸，选用能诱发宿主产生中和抗体的微生物蛋白或表面抗原而制成。

●白喉类毒素、破伤风类毒素

●流感嗜血杆菌荚膜多糖、脑膜炎球菌荚膜多糖

●流感病毒血凝素和神经氨酸酶

●人乳头瘤病毒

优点：除去了病原体中与诱发保护性免疫无关或有害成分，只保留有效的免疫原成分，因而免疫作用明显增强而稳定，可靠性提高，对机体引起的不良反应小。

缺点：需要选用佐剂；不能诱发细胞免疫和黏膜免疫。

将病原体中能诱导保护性免疫应答的目的抗原编码基因克隆后，插入适当的原核或真核表达载体质粒；

再将重组质粒导入细菌、酵母菌或哺乳动物细胞中高效表达目的基因；

分离、提取、纯化目的蛋白而制成。

基因重组亚单位疫苗

(geneticengineeringsubunit

vaccine)活载体疫苗：又称重组载体疫苗，是将有效的目的抗原的编码基因导入活载体（无或弱毒的细菌或病毒株）中，构建重组菌株；目的基因可随重组菌株在宿主体内的增殖而大量表达，从而诱发相应的免疫保护作用。

3、活载体疫苗载体：腺病毒、牛痘病毒、金丝雀痘病毒、伤寒沙门菌减毒株、卡介苗、乳杆菌、枯草芽孢杆菌芽孢等。

病原体：乙型肝炎病毒、狂犬病病毒、痢疾杆菌等。活载体疫苗：又称重组载体疫苗，是将有效的目的抗原的编码基因导入活载体（无或弱毒的细菌或病毒株）中，构建重组菌株；目的基因可随重组菌株在宿主体内的增殖而大量表达，从而诱发相应的免疫保护作用。

3、活载体疫苗载体：腺病毒、牛痘病毒、金丝雀痘病毒、伤寒沙门菌减毒株、卡介苗、乳杆菌、枯草芽孢杆菌等。

病原体：乙型肝炎病毒、狂犬病病毒、痢疾杆菌等。将白斑综合征病毒Vp26基因与枯草芽孢杆菌的衣壳蛋白CotC基因融合，从而将Vp6蛋白展示在芽孢表面制成口服疫苗。该疫苗包被饲料免疫南美对虾后能够起到100％的免疫保护作用。1990年，Wolf等首次发现，给小鼠肌肉注射裸露质粒DNA后，质粒携带的基因可被肌细胞摄取并在其中表达，还可诱生特异性免疫应答。

4、核酸疫苗核酸疫苗具有构建容易、生产方便、表达稳定及可诱发全面的免疫应答等特点，在抗感染、抗肿瘤免疫及疾病的预防等方面具有广阔的应用前景，被誉为疫苗的“第三次革命”。

核酸疫苗：又称DNA疫苗（基因疫苗），是将一种或多种目的抗原的编码基因克隆到真核质粒表达载体上；再将重组质粒直接注入到体内，在宿主细胞内表达目的蛋白，诱发特异性免疫应答。

目前进入临床试验的有HIVDNA疫苗和疟疾DNA疫苗和流感DNA疫苗。

免疫机制：局部注射的核酸（重组质粒DNA）被周围的细胞（如黏膜上皮细胞、抗原提呈细胞）摄取后，进入核内进行转录，并在胞质中翻译成目的蛋白。

目的蛋白被蛋白酶复合体降解成含有表位的抗原肽，可作为：

●“内源性抗原”：与MHCⅠ类分子结合，诱发CTL介导的细胞免疫应答。

●“外源性抗原”：与MHCⅡ类分子结合，诱发偏向Th1型免疫应答。目的蛋白亦可通过细胞分泌或细胞破裂的方式进入组织间，以天然折叠形式激活B淋巴细胞而产生抗体。DNA疫苗接种后，体内仅表达pg～ng水平的外源蛋白，但能诱发强而持久的细胞免疫和体液免疫应答。核酸疫苗的构建与免疫

①目的基因的选择：侧重于免疫原性，即所表达的目的蛋白刺激机体免疫应答的能力。目的蛋白中是否具有受MHC分子限制的T细胞抗原表位，是保证核酸免疫有效的先决条件。

核酸疫苗所选择的目的基因应尽量避免有害基因成分，特别是病毒或肿瘤的核酸免疫。

②载体的选择：构建DNA疫苗的质粒通常是非复制型的真核表达质粒，能高水平地表达目的基因。

重组质粒可分为两个部分：

●

转录部分：由启动子、插入的目的抗原cDNA和polyA终止子组成，指导目的蛋白在体内表达，诱发特异性免疫应答。

●

佐剂部分：CpG基序。③启动子的选择：质粒在宿主细胞内表达外源性蛋白的水平与调控DNA表达的启动子关系密切。表达水平的不同又直接影响免疫应答的强度和持续性。

核酸疫苗与传统疫苗的比较传统免疫所使用的抗原一般是灭活病原体、减毒的活病原体或病原体的亚单位蛋白。

核酸疫苗仅仅是病原体某种抗原的基因片段，