分析SW-BSA对和田羊的免疫原性和安全性,免疫学论文

分析SW-BSA对和田羊的免疫原性和安全性,免疫学论文苦马豆素(SW)属于吲哚里西啶生物碱,最早是从灰苦马豆中分离得到的[1].研究发现,SW是棘豆属[2]、黄芪属[3]等疯草植物的主要有毒成分.疯草在新疆地区分布广泛,不利于该地区畜牧业的发展.疯草属于豆科植物,除含有疯草毒素外,还含有丰富为,SW相对分子质量小,为半抗原,需要将SW与大分子载体蛋白(如BSA)耦联合成人工抗原(SW-BSA),然后用其免疫家畜,诱导产生特异性抗体,可使家畜获得免疫力并在采食疯草时得到保卫.童德文等[8]用SW-BSA免疫莎能奶山羊,以甘肃棘豆作为攻毒饲草进行试验,结果获得一定保卫效果.在国内研究中,还未见用免疫方式方法预防新疆本地家畜疯草中毒的研究报道.本试验用合成的人工抗原免疫新疆特有和田羊,通过检测血清特异性抗体水平和生化指标,分析SW-BSA对和田羊的免疫原性和安全性,以期为防治和田羊疯草中毒奠定基础.1材料.1.1试验动物.和田羊12只,年龄为2岁左右,体重为(28.01.2)kg,购自和田地区策勒县.1.2主要试剂.SW-BSA,由新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室制备;弗氏完全佐剂(FAC)、弗氏不完全佐剂(FAI),购自Sigma公司;谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)、碱性磷酸酶(AKP)、肌酐(CRE)、-甘露糖苷酶(AMA)检测试剂盒,均购自南京建成生物工程研究所;其余常规试剂均为国产分析纯,试验用水为超纯水.1.3主要仪器.全波长酶标仪(型号为PowerWaveXS),购自美国Bio-tek公司;生化分析仪(型号为VetTest8008)、离心机(型号为StatSpinVT),购自北京安普生化科技有限公司;精致细密电子天平(型号为BS124),购自德国SARTORIUS公司;超纯水系统(型号为Di-rect-Q3),购自美国Millipore公司;高速冷冻离心机(型号为MR231),购自法国Jouan公司.2方式方法2.1试验动物处理.试验羊进入羊舍前,先用84消毒液对羊舍进行消毒,观察7d,驱除试验羊体表及体内寄生虫,将试验羊随机分为对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组,每组4只.试验羊自由采食青干草,每只羊每日补饲精料300g,分上午、下午2次饲喂,自由饮水.2.2免疫试验.参照以下为参考文献[8]中的方式方法制备疫苗,使用FAC对各试验组羊进行基础免疫,首免时用FAC和生理盐水的混合液(体积比为1∶1)充分乳化SW-BSA;第1次和第2次加强免疫时用FAI和生理盐水的混合液(体积比为1∶1)乳化SW-BSA;第3次加强免疫时用生理盐水乳化SW-BSA.试验组免疫剂量和次数见表1.2.3血清抗体效价的测定.以首免为第0天,在每次免疫前对试验羊空腹静脉采血,免疫结束后每隔7d采血1次,共采血10次.采用间接血凝试验(IHA)和间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试验羊血清抗体效价的变化.IHA条件参照以下为参考文献[8],红细胞用30g/L的SW致敏.ELISA条件参照以下为参考文献[9],测量样品孔OD450值(P)与阴性对照孔OD450值(N),以P/N2.1断定样品为阳性.2.4血清E-玫瑰花环试验.参照以下为参考文献[10]中的方式方法,计数200个淋巴细胞,凡1个淋巴细胞结合3个红细胞或以上者为1个玫瑰花环阳性细胞,计算玫瑰花环构成率.2.5血清生化指标测定.参照相应检测试剂盒讲明书测定血清中AST、ALT、LDH、AKP、AMA、CRE水平.2.6体液中SW的定性检测.2.6.1尿液中SW的定性检测在采血当日,对试验羊进行人工采尿.参照以下为参考文献[11]中的方式方法分离结晶体,采用薄层层析法检查尿液中能否含有SW.吸附剂为硅胶GF254,展开剂为氯仿∶甲醇∶氨水∶水(70∶26∶2∶2),采用上行法展开.若在薄层板比移值(Rf)为0.48左右处出现紫红色斑点则断定为检测到SW,否则断定检测液中不含SW.2.6.2血液中SW的定性检测取试验羊血清.2mL,参加纯化水1mL,丙酮6mL,超声处理10min(频率为50Hz,温度为37℃),10000r/min离心10min后取上清液,重复上述步骤再处理沉淀物2次,合并上清液,80℃水浴除去丙酮,最后冷冻枯燥得到冻干物[12].该冻干物的检测方式方法同2.6.1.2.7统计学分析.应用SPSS11.5软件中One-WayANOVA方式方法对试验数据进行单因素方差分析及邓肯氏多重比拟,检验误差为5%和1%.3结果与分析.3.1血清抗体效价的检测结果.所有试验羊均在第2次加强免疫后产生了抗SW抗体,经IHA和ELISA检测,试验Ⅰ组和试验Ⅱ组抗体效价均为22;第3次加强免疫后血清抗体效价明显升高,试验Ⅰ组和试验Ⅱ组最高抗体效价分别为26和28;试验组抗体效价均在第3次加强免疫后第14天(第6次采血)到达最高值,并在第3次加强免疫后第35天时(第9次采血)仍保持在较高水平.2个试验组和田羊血清抗体变化趋势较一致,但试验Ⅱ组的抗体效价值始终高于试验Ⅰ组;对照组未检测到抗SW抗体存在.结果见图1.3.2血清E-玫瑰花环试验结果整个免疫试验期内试验组和田羊血清E-玫瑰花环率呈上升趋势,并在第6次采血时到达最高值,然后试验组E-玫瑰花环率的变化趋势趋于平缓.从第3次采血开场,试验Ⅱ组E-玫瑰花环率高于试验Ⅰ组,到第9次采血时2个试验组E-玫瑰花环率差异不显著.对照组E-玫瑰花环率波动较为平缓,但均小于试验组.结果见图2.3.3血清生化指标测定结果.整个试验期内所有和田羊血清中AST、ALT、LDH、AKP、AMA、CRE水平均在正常范围内[13],且试验组与对照组之间差异不显著.结果见图3、图4、图5.3.4试验羊体液中SW的定性检测结果.从第1次采血、采尿开场,到第10次时,试验组和田羊的尿液和血液中均未检测到有SW.4讨论.人工抗原免疫家畜能否产生抗体,不仅与人工抗原的质量和免疫动物个体状况有关,还与免疫程序有关.在一定范围内抗原剂量与免疫反响强度呈正相关,过低与过高都不利于抗体的产生.试验初期使用小剂量抗原免疫家畜,一方面考虑SW抗原决定簇较少,另一方面是由于小剂量能够激活高亲和力的淋巴细胞;后期大剂量免疫则是考虑维持已经产生的抗体和进一步激活更多的淋巴细胞.与童德文等[8]的研究结果相比,本试验抗SW抗体效价的产生时间和周期较为一致,而加强免疫后的28d内抗体效价高于童德文等人的报道,讲明本试验免疫剂量和时间的设计是合理的.E-玫瑰花环率的变化反映了动物机体免疫力的变化[10],华而不实主要受T淋巴细胞的影响.试验组前期E-玫瑰花环率上升,可能是由于人工抗原刺冲动物机体免疫细胞表示出,进而产生了大量高活性的T淋巴细胞,导致E-玫瑰花环率的增加,讲明该免疫反响能够有效阻止进入机体的SW损害动物的免疫系统.试验中固然检测到和田羊血清中出现抗SW抗体,但该抗体能否保卫和田羊在采食疯草时免于中毒,还有待于进一步研究证实.SW为半抗原,不具有完全的免疫原性,只要将其耦联到大分子载体上才能诱导出免疫原性[8].在研究SW人工抗原的免疫原性时,需要分析临床病理学指标,检测SW人工抗原免疫动物时对机体肝脏、肾脏功能的影响,讨论其对动物机体组织器官的影响,并监测尿液和血液中有无SW存在.AST、ALT、AKP和LDH等酶主要分布于肝脏、心脏、骨骼肌等器官和组织,当脏器细胞的完好性遭到损害时,这些酶就逸入细胞外周的组织液,继而到达血液.因而,通过检测血液中这些酶的活性,能够在一定程度上反映器官细胞的受损状况[14],华而不实AKP是家畜疯草中毒后活性最早发生改变的,是极具有诊断意义的一种酶,AST和ALT是肝脏遭到损伤的参考根据,LDH值的急速升高讲明机体发生急性肝细胞、骨骼肌和心肌损伤.抗线粒体抗体在机体低聚糖代谢中起着重要作用,国内外研究结果表示清楚,SW对AMA具有强烈的和特异性的抑制作用[7].血肌酐是肌酸代谢终产物,血液中血肌酐含量的变化可反映肾脏排氮功能的变化,对于断定肾脏损伤程度具有重要意义.本试验中,和田羊在50d的免疫试验和42d的后续观察中均未发现血清酶指标发生特异性变化,尿液检测和血液检测均未发现机体中有SW单体,讲明合成的SW-BSA具有较好的免疫安全性.综上所述,用SW-BSA免疫接种和田羊后可产生高效价的抗SW抗体,血清AST、ALT、AKP、AMA、LDH和CRE水平均在正常范围内,尿液和血液中未检测到SW.讲明SW-BSA能够在和田羊中安全应用.以下为参考文献:[1]COLEGATESM,DORLINGPR,HUXTABLECR.Aspectro-scopicinvestigationofswainsonine:an-mannosidaseinhibitori-solatedfromSwaisonacanescens[J].AustJChem,1979,3