第四章 基因工程概论

第四章基因工程概论

目的了解基因工程的概念及研究的内容

内容基因工程的概念、基本步骤、载体-宿主系统、工具酶与基因工程、目的基因的制备、分子克隆建立和目的基因表达重点工具酶与基因工程、目的基因的制备

难点分子克隆的建立和目的基因的表达学时3第一节、基因工程的概念

一、基因工程的概念

基因工程也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另—种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖(称之为“克隆”)和行使正常功能(称之为“表达”)，从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。—股说来，基因工程是专指用生物化学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体系统的DNA结合成—个复制子。这样形成的杂合分子可以在复制子所在的宿主生物或细胞中复制，继而通过转化或转染宿主细胞、生长和筛选转化子，无性繁殖使之成为克隆。然后直接利用转化子，或者将克隆的分子自转化子分离后再导入适当的表达体系，使重组基因在细胞内表达，产生特定的基因产物。二、基因工程的基本步骤

基因工程的基本内容是有目的地对遗传物质功能单位进行综合，创造有价值的生物分子或新的动物、植物或微生物品系。基因工程的基本步骤主要有包括：①

目的基因的制取；②

基因载体的选择与构建；③

目的基因与载体DNA的拼接；④

重组体分子导入受体细胞，筛选和无性繁殖(克隆)⑤

外源基因的表达和产物的分离纯化。

第二节载体-宿主系统

理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求：①能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力。②容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。③容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这要求载体DNA有合适的限制性核酸内切酶位点。④容易从宿主细胞中分离纯化出来，这才便于重组操作。⑤有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。常用的载体有质粒，噬菌体和病毒等。一、质粒载体

质粒是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。质粒特点①是染色质外的双链共价闭合环形DNA，可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2-300kb之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯化，＞15kb的大质粒则不易提取。②能自主复制，是能独立复制的复制子。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代。③质粒对宿主生存并不是必需的。质粒分类按质粒复制的调控及其拷贝数可分两类：严紧控制型质粒和松弛控制型质粒严紧控制型质粒的复制常与宿主的繁殖偶联，拷贝数较少，每个细胞中只有1个到十几个拷贝；松弛控制型质粒，其复制宿主不偶联，每个细胞中有几十到几百个拷贝。二、噬菌体载体

噬菌体是感染细菌的一类病毒，有的噬菌体基因组较大，如λ噬菌和T噬菌体等；有的则较小，如M13、f1、fd噬菌体等。用感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的载体应用最为广泛。λ噬菌体由头和尾构成，其基因组是长约49kb的线性双链DNA分子，组装在头部蛋白质外壳内部，其序列已被全部测出。λ噬菌体感染时，通过尾管将基因组DNA注入大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。DNA进入大肠杆菌后以其两端12bp的互补单链粘末端环化成环状双链，可以两种不同的方式繁殖：①溶菌性方式：在营养充足，条件适合细菌繁殖时，利用宿主菌中的酶类和原料，λDNA上基因可按调控的顺序表达合成构成噬菌体头、尾和尾丝所需的各种蛋白质，λDNA经多次复制合成许多子代λDNA，于是装配成许多子代的λ噬菌体，最后裂菌，释放出许多新的λ噬菌体。②溶原性方式：进入细菌的λDNA可整合入细菌的染色质DNA中，随细菌染色体DNA复制，传给细菌后代，这个稳定潜伏在细菌染色质DNA中的λDNA称为原噬菌体，含有原噬菌体的细菌称为溶源菌。λDNA的整合是可逆的，原噬菌体可从宿主DNA中切出，进入溶菌性方式的繁殖。λ噬菌体整个基因组，可分为三个部分，①左臂：从A到J长约20kb，其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。②中段：长约20kb，是λDNA整合和切出，溶原生长所需的序列。③右臂：长约10kb，是调控区，控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及λDNA复制起始均在这区域内。左右臂包含λDNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。

三、动物病毒载体质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA重组需要。感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。目前病毒载体常用者有改造来自猴肾病毒SV40、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等，使用这些病毒载体的目的多为将目的基因或序列放入动物细胞中表达或试验其功能、或作基因治疗等第三节工具酶与基因工程

基因工程的操作．是分子水平上的操作，它是依赖一些重要的酶(如限制性内切核酸酶、连接酶、聚合酶等等)作为工具央对基因进行人工切割和拼接等操作，所以把这些酶称为工具酶。一、限制性核酸内切酶的概念

核酸酶可分为两类：核酸外切酶和核酸内切酶核酸外切酶是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；核酸内切酶则从核酸链中间水解3’，5’磷酸二酯键，将核酸链切断。很多细菌和细胞中都能识别外来的核酸并将其分解，1962年发现这是因为细菌中含有特异的核酸内切酶,能识别特定的核酸序列而将核酸切断;同时又伴随有特定的核酸修饰酶,最常见的是甲基化酶,能使细胞自身核酸特定的序列上碱基甲基化,从而避免受内切酶水解,外来核酸没有这种特异的甲基化修饰,就会被细胞的核酸酶所水解.这样细胞就构成了限制一修饰体系,其功能就是保护自身的DNA,分解外来的DNA,以保护和维持自身遗传信息的稳定,这就是限制性核酸内切酶名称中“限制”二字概念的由来。二、限制性核酸内切酶的命名按酶的来源的属、种名而定，取属名的第一个字母与种名的头两个字母组成的三个斜体字母作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按发现的先后写上罗马数字。例如：从流感嗜血杆菌d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。三、限制性核酸内切酶的分类按限制酶的组成、与修饰酶活性关系，切断核酸的情况不同，分为三类：Ⅰ类限制性核酸内切酶

Ⅱ类限制性核酸内切酶

Ⅲ类限制性核酸内切酶四、限制性核酸内切酶的作用大部分限制性核酸内切酶识别DNA序列具有回文结构特征，切断的双链DNA都产生5’磷酸基和3’羟基末端。不同限制性核酸内切酶识别和切割的特异性不同，结果有三种不同的情况：1.产生3’突出粘性末端2.产生5’突出的粘性末端：3.产生平末端第四节目的基因的制备基因工程主要是通过人工的方法，分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而深入开展核酸遗传研究或者获取有价值的基因产物。通常我们把插入在载体内的那个特定的片段基因称为“外源基因”，而将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，称为“目的基因”。随着生物化学、分子遗传学和分子生物学技术的发展，包括基因工程技术本身的进步，如今已有很多基因被分离出来。目前主要应用化学合成法、物理化学法(加密度梯度离心法、单链酶法、分子杂交法)、鸟枪无性繁殖法、酶促合成(逆转录)法等。一、鸟枪法这是一种由生物基因组提取目的基因的方法。首先利用物理方法或酶化学方法将生物细胞染色体DNA切割成为基因水平的许多片段，继而将这些片段与适当的载体结合，将重组DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库，再结合筛选方法，从众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株，从中将重组的DNA分离、回收。这种方法也就是应用基因工程技术分离目的基因，其持点是绕过直接分离出基因的难关、在基因组DNA文库中筛选出目的基因。可以说这是利用“溜散弹射击”原理去‘命中”某个基因。由于目的基因在整个基因组中太少太小，在相当程度上还得靠“碰运气”，所以人们称这个方法为”鸟枪法”或“散弹枪”实验法。二、物理化学法1．物理化学法分离基因的基本原理从几个方面来利用核酸DNA双螺旋之间存在着减基G和C配对、A和T配对的这一特性，以达到从生物基因组分离目的基因的目的。2．物理化学法分由基因的主要方法物理化学法分离基因目前主要有：①密度梯度离心法，②单链酶法．③分了杂交法密度梯度离心法：碱基G-C配对的双链DNA片段密度较大，利用精密的密度梯度超离心技术可使切割适当片段的不同DNA按密度大小分布开来。进而通过与某种放射性标记的mRNA杂交来检验，分离相应的基因。单链酶法：

碱基G-C配对之间有三个氢键，A-T配对之间有二个氢键，G-C配对比A-T配对的稳定性高。当用加热或其他变性试剂处理DNA时，双链上A-T配对较多的部位先变成单链。应用单链特异的S1核酸酶切除单链，再经氯化艳超速离心，获得无单链切口的DNA。分子杂交法：单链DNA与其互补的序列总有“配对成双”的倾向，这就是分子杂交的原理。利用分子杂交的基本原理(如DNA：DNA配对或者DNA：RNA配对)既可以分离又可以鉴别某一基因。三、化学合成基因如果已知某种基因的核苷酸系列，或者根据某种基因产物的氨基酸序列，仔细选择密码子，可以推导出该多肽编码基因的核苷酸序列，就可以将核苷酸或寡核苷酸片段，一个一个地或一片段一片段地缩合起来，成为一个一个基因的核苷酸片段。为了保证定向合成，需要将一个分子的5`末端与另一个分子的3`末端封闭保护。这种封闭可用磷酸化等方法，必要时可以酸或碱解除封闭。四、酶促逆转录合成法酶促逆转录合成法即利用逆转录酶由mRNA逆转录合成的方法。主要用于合成分于量较大而又不知其序列的基因。这种方法是以目的基因的mRNA为模板，借助逆转录酶合成互补的DNA，即cDNA，再在DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA片段，与适当的载体结合后转入受体菌，扩增为cDNA文库。然后，采用适当的方法从cDNA文库巾筛选出目的基同。五、聚合酶链式反应

(PCR)(polymerasechainreaction)

如果已经知道目的基因的序列，就能很方便地用PCR聚合酶链式反应，从基因组DNA或cDNA中获得目的基因，可不必要经过复杂的DNA文库构建过程。PCR是70年代中期创立的技术。聚合酶链式反应(PCR)也可以当作一项极其重要的酶促合成DNA技术，PCR又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，它可将极微量的靶DNA持异地扩增上百万倍。PCR反应系统包括含有目的基因或序列的DNA模板，对热稳定的DNA聚合酶，一对脱氧寡核苷酸引物、DNA合成所需要的4种脱氧核苷三磷酸以及保证聚合酶催化反应的Mg2+及缓冲液等。人工合成引物的序列设计是PCR成功的关键，一般两条引物的序列反应分别与欲获得的双链DNA两条链3’端的序列互补。先升高温度使模板DNA变性、双链分开；再降低温度退火使引物与模板DNA配对互补结合；然后升温到聚合酶反应适宜的温度，此时在聚合酶催化下，从引物3’羟基端开始，与模板DNA上的碱基配对逐个加上核苷酸，合成新的DNA链。其后再按高温变性、低温退火、适温合成三步反复循环，新合成的DNA在下一循环中又作为模板使用.

第五节分子克隆的建立和目的基因的表达一、目的基因与载体的连接将目的基因或序列插入载体，主要靠DNA连接酶和双链DNA粘末端单链序列互补结合的配合使用。有以下主要的方式。1、粘性末端连接目的基因两端有与载体上相同的限制性核酸内切酶位点，则同一限制酶切开产生的粘末端，在降低温度退火时，能重新互补结合，在DNA连接酶催化下，目的基因就与载体DNA链相连接。不同的限制性内切酶切，如果产生的DNA的粘末端相同，也同样可用此法连接。如果在连接的两个DNA片段没有能互补的粘性末端，可用末湍核苷酸转移酶催化脱氨单核苷酸添加DNA的3’末端.

2、平末端连接

T4DNA连接酶也能催化限制性内切酶切割产生DNA平末端的连接。如果目的序列和载体上没有相同的限制性内切酶位点可供利用，用不同的限制性内切酶切割后的粘性末端不能互补结合，则可用适当的酶将DNA突出的末端削平或补齐成平末端，再用T4DNA连接酶连接，但平末端连接要比粘性末端连接的效率低得多。

二、基因序列导入细胞目的基因序列与载体连接后，要导入细胞中才能繁殖扩增，再经过筛选，才能获得重组DNA分子克隆，不同的载体在不同的宿主细胞中繁殖，导入细胞的方法也不相同。1、转化由于外源DNA的进入而使细胞遗传性改变称为转化。但DNA进入细胞的效率很低，在分子生物学和基因工程工作中可采取一些方法处理细胞，经处理后的细胞就容易接受外界DNA，称为感受态细胞，再与外源DNA接触，就能提高转化效率。例如大肠杆菌经冰冷CaCl2的处理，就成为感受态细菌，当加入重组质粒并突然由4℃转入42℃作短时间处理，质粒DNA就能进入细菌；用高电压脉冲短暂作用于细菌也能显著提高转化效率，这称为电穿孔转化法。2、感染噬菌体进入宿主细菌，病毒进入宿主细胞中繁殖就是感染。用经人工改造的噬菌体活病毒作载体，以其DNA与目的序列重组后，在体外用噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA包装成有活力的噬菌体或病毒，就能以感染的方式进入宿主细菌或细胞，使目的序列得以复制繁殖。感染的效率很高，但DNA包装成噬菌体或病毒的操作较麻烦。3、转染重组的噬菌体DNA也可象质粒DNA的方式进入宿主菌，即宿主菌先经过CaCl2，电穿孔等处理成感受态细菌再接受DNA，进入感受态细菌的噬菌体DNA可以同样复制和繁殖，这种方式称为转染。三、目的基因序列克隆的筛选与鉴定目的序列与载体DNA正确连接的效率、重组导入细胞的效率都不是百分之百的，因而最后生长繁殖出来的细胞并不同都带有目的序列。一般一个载体只携带某一段外源DNA，一个细胞只接受一个重组DNA分子。最后培养出来的细胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重组体。将目的重组体筛选出来就等于获得了目的序列的克隆，所以筛选是基因克隆的重要步骤。在构建载体，选择宿主细胞、设计分子克隆方案时都必须仔细考虑筛选的问题。

1、根据重组载体的标志作筛选

最常见的载体携带的标志是抗药性标志，

2、核酸杂交法利用标记的核酸做探针与转化细胞的DNA进行分子杂交，可以直接筛选和鉴定目的序列克隆。常用的方法是将转化后生长的菌落复印到硝酸纤维膜上，用碱裂菌，菌落释放的DNA就吸附在膜上，再与标记的核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在含有目的序列的菌落DNA上而不被洗脱。核酸探针可以用放射性核素标记，结合了放射性核酸探针的菌落集团可用放射性自显影法指示出来，核酸探针也可以用非放射性物质标记，通常是经颜色呈现指示位置，这样就可以将含有目的序列的菌落挑选出来。

3、PCR法

PCR技术的出现给克隆的筛选增加了一个新手段。如果已知目的序列的长度和两端的序列，则可以设计合成一对引物，以转化细胞所得的DNA为模板进行扩增，若能得到预期长度的PCR产物，则该转化细胞就可能含有目的的序列。4、免疫学方法利用特定抗体与目的基因表达产物特异性结合的作用进行筛选。此法不是直接筛选目的基因，而是通过与基因表达产物的反应指示含有目的基因的转化细胞，因而要求实验设计要使目的基因进入受体细胞后能够表达出其编码产物。抗体可用特定的酶常用过氧化物酶、碱性磷酸酶等标记，结合酶标抗体处，酶可催化特定的底物分解而呈现颜色，从而指示出含有目的的基因的细胞集落位置。免疫学方法特异性强、灵敏度高，适用于从大量转化细胞集合体中筛选很少几个含目的基因的细胞克隆。5、DNA限制性内切酶图谱分析这是在上述筛选后的进一步分析。目的序列插入载体会使载体DNA限制性酶图谱发生变化，例如一个长600bp的目的序列利用它两端的EooR