第八章 生物样品内中药制剂化学成分的测定

第八章生物样品内中药制剂化学成分简介药物分析教研室2/4/20231体内药物分析第一节概述第二节

生物样品的种类、采集、制备与贮存第三节生物样品的预处理与制备

内容提要第三章生物样品与样品制备2/4/20232体内药物分析第一节概述一、生物样品内药物分析的性质、意义和任务（一）生物样品内药物分析的性质生物样品内药物分析，又称体液药物分析、生物药物分析，是随着临床药学、临床药理学的发展和需要而建立起来的一门新兴学科。旨在通过各种分析手段，了解药物在生物样品内的数量和质量变化，获得药物代谢动力学的各种参数、药物在生物样品内的生物转化、代谢的方式和途径等信息，从未为药品生产、临床医疗、实验研究等方面对栓研究的药物作出估计与评价，对药物的改进与发展作出贡献。2/4/20233体内药物分析（二）生物样品内药物分析的意义1、生物样品内药物分析在新药评价和新药开发中的意义大量事实证明，如无临床药理学和临床药学研究给新药以确切的评价，要做到临床安全、合理、有效地用药将会遇到许多困难。因此，加强药物在生物样品内作用机理的研究，以了解和阐明药物药物结构、理化性质、剂型及生产工艺与药物疗效等关系，已成为评价药品质量的重要内容和依据。2/4/20234体内药物分析2、生物样品内药物分析在临床合理用药中的意义

影响血药浓度的因素很多，同一种给药方案难以对每一个病人都达到理想的治疗效果，为达到用药安全、合理、有效，必须设计个体化给药方案，久需要好对治疗药物监测，以血药浓度为指标，达到个体化用药。2/4/20235体内药物分析（三）生物样品内药物分析的任务1.在药物浓度监测中的应用只有具有明确治疗范围，血药浓度和药效关系密切，且具有下列情况者，要求进行农药检测：有效血药浓度范围窄，剂量小，毒性大的药物；药代动力学个体差异大、药理作用强、不易估计给药后的血药浓度药物；药物的毒性反应与该药治疗的疾病症状相似，难以判断是剂量不足还是药物毒性所致；联合用药时，由于药物相互作用产生不良反应，需要调整药物剂量者；在短期内难于判断疗效的药物，预测药物能否达到预防效果；判断患者用药的依从性等要求进行药物浓度检测。2/4/20236体内药物分析2.在药代动力学研究中的应用通常涉及药物在生物样品内的吸收、分布、代谢和排泄等过程，常研究药浓-时间曲线变化。生物制品内内源性物质的含量，对于疾病的诊断或及早预防具有重要的意义。3.分析方法学的研究分析方法学研究，提供合理的最佳分析条件，估计、评定各种方法达到的灵敏、专属、准确程度、探讨各种方法应用与生物样品内药物分析中的规律性，为临床药学的研究提供准确、灵敏、快速的分析方法。2/4/20237体内药物分析二、生物样品内药物分析的对象与特点（一）生物样品内药物分析的对象凡是生物样品内药物到达之处，如体液、器官、组织、排泄物等都是分析的对象，所以生物样品内药物分析的样本有血液、尿液、唾液、胆汁、淋巴液、泪液、脊髓液、汗液、乳汁、各种器官以及呼出的气体等。生物样品内药物分析的目标，不仅是母体药物也包括代谢产物，因为代谢产物常具有生理活性，弄清它们的种类、结构、数量及分布情况，可了解药物在生物体内的变化及消除规律，这对安全用药和正确评价药物质量也是非常重要的。由于新药进入临床试验之前，或者对老药在某一方面的重新评价，一般要求现在动物体上进行实验，所以生物样品内药物分析对象不仅是人体，也包括动物体。2/4/20238体内药物分析（二）生物样品内药物分析的特点与常规药物分析相比，生物样品内药物分析在灵敏度和选择性等方面有较高的要求。微量药物存在于大量生物介质中，样品中含内源性干扰杂质，这些干扰物质又随疾病情况不同而有所不同。很多药物在生物样品内经过代谢可产生一种或多种代谢物，母体药物和代谢物又能同生物大分子结合，这一切给药物分离、分析带来困难，这就要求分析方法具有更高的选择性。另外，在生物样品中，药物浓度都很低，一般血药浓度在10-6-10-9g/ml之间，且生物样品若为血液，采集量又受到一定限制，因此要求分析方法要有较高的灵敏度。1.干扰杂质多2.样品量少3.要求较快提供结果。2/4/20239体内药物分析一、生物样品的种类、采集和制备

血液(血浆、血清)—体现药物浓度和治疗作用之间的关系(联接)——最常用的生物样本

第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集生物样品脏器组织体液血液、尿液、唾液、毛发、乳汁、精液、脑脊液、泪液、胆汁、胃液、胰液、淋巴液、粪便等2/4/202310体内药物分析尿液—用于药物剂量回收、尿清除率、生物利用度、内源性活性物质、药物代谢分型及代谢物等的研究测定第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集唾液—用于某些S/P较为恒定的药物的测定一、生物样品的种类、采集和制备

2/4/202311体内药物分析第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集肝、胃、肾、肺、脑等脏器组织

—动物试验研究药物吸收、分布状态及服药过量中毒死亡

毛发

—可用于药物滥用监测及微量元素测定一、生物样品的种类、采集和制备

2/4/202312体内药物分析（一）血液（blood）

因血液中药物浓度可以较好地体现药物浓度和治疗作用之间的关系，是最为常用的生物样品—分为全血、血浆和血清

第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集2/4/202313体内药物分析1.

血样的采集第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集

一般用注射器直接采集静脉血，每次1~5ml；动物实验时，采血量不宜超过动物总血量的十分之一2/4/202314体内药物分析

测定血中药物的浓度，通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，尤其是血浆，并非指全血

第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集2.

血样的制备2/4/202315体内药物分析第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集血浆的制备

采集的静脉血液置含有抗凝剂的试管中，混合后，以2500~3000r/min离心5~10min使与血球分离，所得淡黄色上清液即为血浆（plasma）

抗凝剂—最常用的是肝素（heparin）其它抗凝剂EDTA、枸橼酸盐、草酸盐等2/4/202316体内药物分析血清的制备

采集的静脉血液置试管中，于37℃或室温放置30min~1h。血液凝固后，用细竹棒或玻璃棒轻轻剥去试管壁上的血饼，再在2500~3000r/min离心5~10min，上层淡黄色液体即为血清（serum）

第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集2/4/202317体内药物分析第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集血清比血浆只是少一种纤维蛋白原

C血浆=C血清血浆比血清的分离快，而且制取量约为全血的50%~60%（血清为全血的20%~40%），多数用血浆进行分析。若血浆中含有的抗凝剂对药物浓度测定有影响时，则应使用血清样品

血浆与血清的区别2/4/202318体内药物分析

全血的制备第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集成分血浆有形物质红细胞白细胞血小板2/4/202319体内药物分析全血的制备第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集某些情况血浆内药物浓度波动大，或血浆浓度低，可用全血（全血净化较血浆和血清麻烦）血浆和红细胞中分配比不是常数，则应使用全血样品例：三环类降压药在个别病人体内血浆和红血球中的分配比不是一个常数，故宜采用全血样品进行药物动力学的研究2/4/202320体内药物分析全血制备

将采集的血液置含有抗凝剂的试管中，但不经离心操作，保持血浆和血细胞均相状态，即为“全血”（wholeblood）

第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集2/4/202321体内药物分析

血样主要应用于：

药物动力学

生物利用度

临床治疗药物浓度监测第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集血样的应用2/4/202322体内药物分析（二）尿液(urine)

尿液用于药物剂量回收、药物尿清除率、生物利用度的研究，预测药物代谢过程、类型体内药物清除主要是通过尿液排出，药物以原型、Ⅰ相及Ⅱ相代谢物等多种形式排出

第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集2/4/202323体内药物分析（二）尿液(urine)

第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集性状—淡黄色或黄褐色，相对密度

1.105~1.020，pH4.8~8.0成分—水、含氮化合物、盐类等微生物—防腐剂2/4/202324体内药物分析尿液的采集

样本来源—自然排尿，成人一日排尿量为1~5L（随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时间尿）

第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集样本采集—一般采集时间尿（规定时间内采集尿液体积和排入尿中的药物总量2/4/202325体内药物分析（三）唾液（saliva）

唾液—无损伤取样，易收集；一些药物的唾液药浓(S)与血浆游离药浓(P)密切相关，因此：

—TDM中利用对S的测定代替对P的监测

—药代动力学的研究

第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集2/4/202326体内药物分析唾液采集

在潄口后15min，安静状态下采集口腔内自然流出的唾液；也可在刺激下快速采样(需注意干扰)

第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集2/4/202327体内药物分析唾液采集

第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集物理法：口嚼石腊片、聚四氟乙烯块或纱布球等化学法：将柠檬酸或维生素C等置于舌尖，弃去初始部分后采集化学法的优点：缩短采样时间减小唾液pH波动（pH≈7.0），S/P个体差异小2/4/202328体内药物分析

唾液样品采集后，应立即测量其除去泡沫部分的体积，以3000rpm离心10min，取上清液直接测定或冷冻保存 第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集唾液样品的制备2/4/202329体内药物分析第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集

非伤害性方法，病人易接受

采集不受时间、地点限制，易收集

灵敏度较高的血药浓度测定方法可以直接或稍加改进使用

一些药物的唾液药物浓度(S)与血浆游离药物浓度(P)密切相关，可使用唾液样品唾液样品的特点2/4/202330体内药物分析

TDM—如苯妥英钠的Cs/Cp比值恒定、个体差异小，可用于癫痫病人的TDM

药代动力学参数测定—用GC-MS分析测定可卡因，血浆和唾液中的t1/2分别为3.8h和7.9h第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集唾液样品的应用2/4/202331体内药物分析（四）器官组织（tissue）

第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集1．匀浆化法

加入一定量的水或缓冲液，在刀片式匀浆机中匀浆，使被测药物溶解，取上清液供萃取用

—方法简单、但回收率低组织处理的一般方法有：用于动物试验药物动力学研究临床服用药物引起中毒死亡2/4/202332体内药物分析2．沉淀蛋白法

在组织匀浆中加入蛋白沉淀剂，沉淀蛋白质后取上清液供萃取用，操作简单、但回收率低，较为常用.第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集（四）器官组织（tissue）

2/4/202333体内药物分析第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集3．酸水解或碱水解

组织匀浆中加入适量的酸或碱，置水浴中加热，待组织液化后，过滤或离心，取上清液供萃取用适用对热稳定的药物，应用较少。（四）器官组织（tissue）

2/4/202334体内药物分析

组织匀浆中加入适量的酶和缓冲液，置水浴上水解一定时间，待组织液化后，过滤或离心，取上清液供萃取用最常用的酶—枯草菌溶素（一种细菌性碱性蛋白分解酶，可在pH7.0~11.0较宽的范围内使蛋白的肽键降解，在50~60℃具有最大活力）

第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集返回去除蛋白质方法4．酶水解法（四）器官组织（tissue）

2/4/202335体内药物分析

优点—酶解法操作简便

—避免药物在酸及高温下降解

—对与蛋白结合紧密的药物，可显著改善回收率

—可用有机溶剂直接萃取酶解液而无乳化现象生成

缺点—不适用于在碱性下易水解的药物第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集返回去除蛋白质方法4．酶水解法（四）器官组织（tissue）

2/4/202336体内药物分析（五）头发（hair）

第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集应用—体内微量元素含量测定

—用药史的估计

—临床用药和药物非法滥用的区别、毒性药物检测2/4/202337体内药物分析（五）头发（hair）

优点—取样方便、可重复采样

—通过测定某些特定的代谢物将

药物滥用和临床用药相区别

—能获数月~数年的长期用药信息缺点—预处理繁杂、干扰多

—分析对象的含量低、需精密仪器

第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集2/4/202338体内药物分析1．广谱性（代谢产物及微量元素排泄器官）2．积累性（长期富集各代谢产物）3．稳定性（ 水分含量少）

4．依时性（反应某时期药物的积累）5．相关性（与人体内部器官相关）6．指纹性（环境、饮食等）第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集（五）头发检测的性质2/4/202339体内药物分析

采集—代表性和同一性

—采集枕部发样

—微量元素在前额部位的头发中含量最低，枕部含量最高

洗涤—除去外源性污染物

第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集（五）头发的采集与洗涤2/4/202340体内药物分析

毛发样品的制备

1．毛发中药物的提取—常用方法：

直接用甲醇提取

酸水解(0.1mol/L盐酸)

碱水解(1mol/L氢氧化钠)

酶水解(-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶)2．有机破坏法

第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集返回第一节2/4/202341体内药物分析二、生物样品的贮存与处理

冷藏—冰箱(4℃)中短期保存(1~2d)

冷冻—冷柜(-20℃)或低温冷柜(-80℃)

中长期保存

冷藏或冷冻时限经稳定性考察后确定返回第一节第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集2/4/202342体内药物分析生物样品的贮存

血样

采集后及时分离血浆和血清（≤2h），分离后再贮存

—若不予先分离，血凝后冰冻保存，则因冰冻有时易引起细胞溶解，会阻碍血浆或血清的分离

—置硬质玻璃试管中完全密塞后保存

第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集2/4/202343体内药物分析

尿样

采集后应立即测定，若不能立即测定，加入防腐剂后保存 常用防腐剂：甲苯、二甲苯、氯仿、醋酸、浓盐酸等

甲苯在尿液表面形成薄膜醋酸改变尿液酸碱性抑制细菌的生长 保存时间为24~36h(4℃)或长期(-20℃)第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集生物样品的贮存

2/4/202344体内药物分析

唾液

为阻止酶催化生成粘蛋白，应在4℃以下保存

—保存过程中放出二氧化碳而使pH升高，测定唾液pH时应在取样的当时为好

—冷冻保存唾液时，解冻后有必要将容器内唾液充分搅匀后再用，否则测定结果会产生误差

第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集

第一节返回第三章生物样品的贮存

2/4/202345体内药物分析

注意事项：

1．冷冻的样品测定时，需临时解冻。解冻后的样品应一次性测定完毕，不应反复冻融

2．如果采集的样品不能一次性测定，则应以小体积分装贮存，每次按计划取一定数量进行测定第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集

第一节返回第三章生物样品的贮存

2/4/202346体内药物分析第三节生物样品的预处理与制备

样品预处理技术

分离、纯化、富集或化学衍生化等，为药物的最终测定创造良好的条件

第三章生物样品与样品制备

第一节返回第三章2/4/202347体内药物分析

样品的预处理是体内药物分析中极为重要的环节；也是分析中最困难、最繁杂的工作

——对于生物样品的预处理很难规定固定的程序和方式，必须结合测定实际和要求，采取恰当的方法和技术第三章生物样品与样品制备

第一节返回第三章第三节生物样品的预处理与制备2/4/202348体内药物分析本节内容：一、生物样品预处理的目的二、样品制备时应考虑的问题

三、生物样品的预处理与制备技术

第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理

第一节返回第三章2/4/202349体内药物分析一、生物样品预处理的目的

使药物从缀合物及结合物中释放

——测定药物的总浓度

使样品纯化——消除生物基质中内源性物质的干扰

提高检测灵敏度——适应和符合测定方法要求的灵敏度

防止分析仪器的污染和劣化——提高分析仪器的耐受程度、改善分析结果第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理2/4/202350体内药物分析（一）使药物从缀合物及结合物中释放

药物——吸收——蛋白结合物

Ⅰ相代谢——代谢物

Ⅱ相代谢——缀合物在体内存在形式：游离型药物+代谢物

+药物或代谢物与蛋白结合物

+药物或代谢物Ⅱ相代谢的缀合物预处理—药物或代谢物从“结合物”或缀合物中释放，测定药物或代谢物的总浓度第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理2/4/202351体内药物分析（二）使样品纯化

生物样品的基质——组成复杂、干扰多

血清中含有高分子的蛋白质和低分子的糖、脂肪、尿素等有机物，也含有Na+、K+、Cl-等无机物

尿液中含有尿素、肌酸、尿囊素、氨、Na+、K+、Cl-等

药物组分——药物含量低，一般为g或

ng水平，经预处理使纯化、富集第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理2/4/202352体内药物分析（三）提高检测灵敏度预处理—降低背景噪音—提高灵敏度特异性强、灵敏度高的分析方法

—预处理简单不具备分离功能的方法(光谱法)

—

预处理十分重要第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理2/4/202353体内药物分析（四）防止分析仪器的污染和劣化

生物样品基质中脂肪、蛋白质、不溶性颗粒污染分析仪器

根据分析仪器的耐受程度，选择不同的预处理方法

第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理返回第二节2/4/202354体内药物分析

高效液相色谱法—去除血浆（或血清）中的蛋白质

第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理返回第二节（四）防止分析仪器的污染和劣化2/4/202355体内药物分析预处理—改善分析结果的准确度与精密度，延长色谱柱的寿命（除固体杂质）

—改善选择性（排除生物基质的干扰）

—改善组分可测性（被测组分的富集）

—改善组分色谱行为（化学衍生化）2/4/202356体内药物分析二、样品制备时应考虑的问题

1．被测组分的理化性质、存在形式、浓度范围2．测定目的3．生物样品种类和基质的干扰类型

第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理返回第二节2/4/202357体内药物分析二、样品制备时应考虑的问题

4．样品的化学组成5．药物的蛋白结合率6．被测组分在预处理过程中的稳定性7．样品在收集、储存和预处理中容器的污染8．保证必要的专属性、灵敏度、精密度和准确度的前提下预处理过程尽量简单第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理返回第二节2/4/202358体内药物分析1.药物的理化性质和存在形式酸碱性(pKa)、溶解性——提取性质挥发性——挥发损失及气相色谱法的应用光谱特性——分析仪器的选择官能团性质——化学衍生化和检测器应用化学稳定性——处理条件的选择存在形式及血浆蛋白结合率——预处理方法

第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理2/4/202359体内药物分析2.待测药物的浓度范围不同药物在体内中浓度相差极为悬殊

——地高辛治疗血浓为1~2ng/ml ——水杨酸盐治疗血浓为20~100g/ml

浓度大——预处理要求稍低 浓度低——样品制备要求高第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理返回第二节

二、样品制备考虑2/4/202360体内药物分析3.药物测定目的

药物测定目的不同——样品预处理的要求不同：

急性中毒病例

——要求快速鉴定所怀疑的药物，应在尽可能短的时间内获得其浓度的数据，对样品预处理的要求可以粗放些

第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理返回第二节

二、样品制备考虑2/4/202361体内药物分析3.药物测定目的

测定药物及代谢物

——要求使代谢物从缀合物中释放出来并在不同pH介质中分离获得酸性、中性或碱性代谢物，对样品预处理的要求全面、细致第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理返回第二节

二、样品制备考虑2/4/202362体内药物分析4.选用的生物样品类型

待测生物样品的类型决定样品预处理方法：

血浆、血清——常需去除蛋白质

唾液——主要采用离心沉淀除去粘蛋白

尿液——常采用酸或酶法使缀合物水解

头发——需要将头发进行有机破坏后测定微量元素第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理返回第二节

二、样品制备考虑2/4/202363体内药物分析5.样品预处理与分析技术的关系

1.分析方法特点(是否专属、是否具有分离能力) 2.检测系统对杂质污染的耐受程度决定样品预处理和需要净化的程度

第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理返回第二节

二、样品制备考虑2/4/202364体内药物分析三、生物样品的预处理与制备技术

生物样品的预处理大致分为以下五类

1．有机破坏法

2．去除蛋白法

3．溶剂萃取法

4．缀合物的水解

5．化学衍生化法第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理返回第二节2/4/202365体内药物分析（一）有机破坏法

应用——微量元素测定

方法

1．湿法破坏

2．干法破坏

3．氧瓶燃烧法返回毛发样品的制备

三、预处理与制备第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理2/4/202366体内药物分析1.

湿法破坏

常用试剂—硝酸或硝酸-高氯酸

特点—破坏能力强、反应激烈，无机金属离子为高价态

应用—适用于血、尿、组织等生物样品的破坏

缺点—含氮杂环药物的破坏不够完全

注意—切勿蒸干、以免爆炸

样品用量—金属元素量10~100g，血样

10~15ml、尿样50ml返回毛发样品的制备第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理2/4/202367体内药物分析返回毛发样品的制备第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理高温炉高温破坏应用——适合人发样品的破坏2.

干法破坏2/4/202368体内药物分析3.氧瓶燃烧（oxygenflaskcombustion）

特点——操作简单、快速、设备简单 仪器装置——附图二

返回毛发样品的制备第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理2/4/202369体内药物分析应用——血浆、人发中卤素、硫、硒等血浆：血浆1ml分次点于无灰滤纸上→60℃烘干→按规定折叠后固定

人发：洗净、干燥（60℃~80℃）→剪碎→称取0.1~0.3g置无灰滤纸中心→按规定折叠固定2/4/202370体内药物分析（二）去除蛋白质

非破坏性生物样品预处理的第一步可使结合型药物释放

1.去除蛋白后取上清液直接分析测定

2.去除蛋白后取上清液经进一步分离纯化、浓集后分析测定第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理返回第二节

三、预处理与制备2/4/202371体内药物分析

去除蛋白质的方法

1.加入与水混溶的有机溶剂—蛋白质脱水沉淀2.加入中性盐—“盐析”沉淀蛋白质3.加入强酸—与蛋白质阳离子(铵基)

形成不溶性盐沉淀

第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理2/4/202372体内药物分析

去除蛋白质的方法

4.加入重金属盐—与蛋白质阴离子

(羧基)形成不溶性盐沉淀5.超滤法—半透膜滤除可溶性生物大分子物质(蛋白质)6.酶水解法—蛋白分解酶分解蛋白质7.加热法—蛋白质变性凝固第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理2/4/202373体内药物分析1.

加入与水相混溶的有机溶剂常用有机溶剂:乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃血样与溶剂体积比—1∶(1~3)可除去90%以上蛋白质(附图三)

第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理乙腈—块状絮凝物、易于分离；成分损失可能性大，上清液pH为8.5~9.5甲醇—细小颗粒沉淀、不易分离；成分损失可能性小，上清液pH为8.5~9.5超速离心分离（12000r/min)—离心1~2min2/4/202374体内药物分析2.

加入中性盐常用中性盐—饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等试剂用量—血清与饱和硫酸铵比例为1∶2时除去90%以上的蛋白质(附图四)

分离—高速(12000r/min)离心 上清液液性——pH7.0~7.7第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理2/4/202375体内药物分析3.加入强酸常用的强酸——10%三氯醋酸、6%高氯酸、

5%偏磷酸等试剂用量——血清与强酸比例为1∶0.6时，除去90%以上的蛋白质(附图四)分离——高速(12000r/min)离心1~2min上清液液性——pH0~4过量三氯醋酸——煮沸分解为氯仿和二氧化碳高氯酸——碳酸钾、醋酸钾或氢氧化钠等中和后加乙醇使产生高氯酸钾（钠）沉淀第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理2/4/202376体内药物分析4.

加入含锌盐及铜盐的沉淀剂

当溶液pH高于蛋白质的等电点时，蛋白质分子中带阴电荷的羧基与金属阳离子形成不溶性盐沉淀

常用沉淀剂—CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH

血清与沉淀剂比例—1∶(1~3)，分离—高速(10000r/min)离心 上清液液性—pH分别为5.7~7.3和6.5~7.5第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理2/4/202377体内药物分析5.

超滤法性质—以多孔性半透膜(超滤膜)作为分离介质的一种膜分离技术；特点—无需加热；无需添加化学试剂；无相变化；无破坏性应用—游离药物首选方法，尤其适合TDM操作—分子量截留值在5万左右的超滤膜过滤可将分子量大的血浆蛋白以及结合了的药物的血浆蛋白分离第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理2/4/202378体内药物分析

6．酶水解法

加入适量的酶和缓冲液，置水浴上水解一定时间，过滤或离心，取上清液供萃取用

最常用的酶—蛋白水解酶中的枯草菌溶素可在较宽的pH范围(pH7.0~11.0)内使蛋白的肽键降解，在50~60℃具有最大活力

第三章生物样品与样品制备第一节生物样品的种类采集返回去除蛋白质方法2/4/202379体内药物分析7.

加热法

测定对热稳定性好的组分时，可采用加热的方法将一些热变性蛋白沉淀 加热温度视欲测组分的热稳定性而定，通常可加热到90℃；蛋白沉淀后可用离心或过滤除去

优点——方法最简单

缺点——只能除去热变性蛋白

第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理2/4/202380体内药物分析（三）分离、纯化与浓集

在生物样品的制备过程中，进行选择性分离、纯化与浓集

分离—消除内源性物质、代谢物或其它共存药物的干扰

纯化与浓集—提高被测药物的灵敏度

样品经分离、纯化与浓集与测定方法相结合，达到专属性强、灵敏度高、准确性好

第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理返回第二节

三、预处理与制备2/4/202381体内药物分析生物样品的分离、纯化方法

——液—液萃取法(传统的方法) ——固相萃取法(液—固萃取法) ——自动化固相萃取技术

——固相微萃取

——膜萃取技术

——微透析技术

——超临界流体萃取法第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理2/4/202382体内药物分析1.

液—液萃取法

（liquid-liquidextraction,LLE）大多数药物为脂溶性，在有机溶剂中溶解度大于水中

大多数内源性杂质是强级性的水溶性物质采用有机溶剂萃取法第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理2/4/202383体内药物分析2/4/202384体内药物分析

1.

液—液萃取法

（liquid-liquidextraction,LLE）溶剂选择—合适的溶剂是成功的主要条件①了解药物与溶剂的化学结构及其性质

—相似相溶的原则②对药物未电离分子可溶，电离形式分子不溶③沸点低、易挥散，毒性小与水不相混溶④不影响紫外检测⑤具有较高的化学稳定性和惰性 第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理2/4/202385体内药物分析液-液萃取法

有机溶剂萃取次数

—通常为1次，必要时2~3次有机溶剂每次用量

—与水相体积比通常为1:1或2~5:1

通过萃取回收率确定最佳萃取次数与每次的溶剂用量第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理2/4/202386体内药物分析由药物的pKa确定碱性药物最佳pH值：高于pKa值1~2个

pH单位酸性药物最佳pH值：低于pKa值1~2个

pH单位一般规则：碱性药物在碱性pH值、酸性药物在酸性pH值介质中提取

第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理液-液萃取法水相pH值:2/4/202387体内药物分析

生物样品宜在碱性或近中性提取，生物基质中内源性物质多为酸性，在碱性下不易萃取 空白血清在pH2、pH7和pH13缓冲液中乙醚提取，提取液用RP-HPLC(UV)测定，碱性药物在pH13下提取液杂质峰少

第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理液-液萃取法水相pH值:2/4/202388体内药物分析空白血清乙醚提取物的HPLC色谱图第三章附图五返回液-液萃取(续)pH13pH7pH22/4/202389体内药物分析其他方法

①离子对提取法（ion-pairextraction）②提取烷基化法（extractivealkylation）

——适用于离子化倾向较大，难以用溶剂直接提取的极性药物第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理2/4/202390体内药物分析离子对提取法

一种有机溶剂提取离子性药物的方法

原理：在体液(水溶液)中呈离解状态的酸性或碱性有机药物(Q)，与呈相反电荷离子(X)作用形成具有一定脂溶性的离子对(QX)，再用有机溶剂提取

第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理2/4/202391体内药物分析

DQ——分配系数，表示药物在有机相和水相中的摩尔浓度比，数值越大，提取到有机相中的药物量越多

DQ值的大小——由提取常数EQX和水相中反离子浓度[X-]aq决定第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理以碱性药物为例，反应式如下：2/4/202392体内药物分析

测定碱性药物——用烷基磺酸盐

（RSO3-）作为反离子

如戊~辛烷磺酸钠、月桂磺酸钠等测定酸性药物——用烷基季铵类化合物

（R4N+·X-）作为反离子

如氢氧化四乙基铵、四丁基铵、四辛基铵等

第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理反离子的选择2/4/202393体内药物分析

选用对离子对溶解度大的溶剂氯仿、二氯甲烷等

有机相与水相比例1：1或2：1第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理常用的提取溶剂2/4/202394体内药物分析

体液中呈阴离子状态的药物主要有磺酸类、羧酸类及代谢物葡萄醛酸苷等体液中能离解成阳离子的药物主要是有机胺类，尤其是季铵类药物第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理离子对提取应用的药物2/4/202395体内药物分析

第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理反相离子对提取法应用皮质酮葡醛酸缀合物的离子对提取因含有羧基药物呈阴离子状态存在反离子——四戊基铵有机相——氯仿2/4/202396体内药物分析

2.

固相萃取法

（Solid-phaseextraction,SPE）

原理

将不同填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的生物样品溶液通过时，由于受到吸附、分配、离子交换或其它亲和力作用，药物或杂质被保留在固定相上，用适当溶剂清洗杂质，再用适当溶剂洗脱药物。第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理返回(三)样品的分离与纯化2/4/202397体内药物分析2/4/202398体内药物分析常用洗脱方式①药物与固定相的亲和力比杂质强而被保留，用一种对药物亲和力更强的溶剂洗脱②杂质与固定相的亲和力比药物强药物被直接洗脱

第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理返回(三)样品的分离与纯化固相萃取法2/4/202399体内药物分析固相萃取法

固相的选择原则

固相与被测组分应具有相似的极性①亲脂型（大孔吸附树脂、亲脂性键合相硅胶）②亲水型（硅胶、硅藻土、棉纤维）③离子交换型

第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理2/4/2023100体内药物分析固相萃取法实验步骤第一步：用甲醇润湿小柱，活化填料第二步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱

—除去残留的甲醇第三步：加样，使样品经过小柱，弃去废液第四步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱，去除内源性杂质第五步：选择适当的洗脱溶剂洗脱被分析物，收集洗脱液，挥干溶剂，备用或直接进行在线分析第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理2/4/2023101体内药物分析固相萃取法注意：

1.血浆样品可直接上柱

2.样品量0.1~2ml3.流速1~2ml/min第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理2/4/2023102体内药物分析固相萃取法方法特点优点①引入杂质少②完全避免乳化的形成③在优化条件下有较高萃取率、重现性较好④使用的溶剂大多可与水混溶，易于自动化

第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理缺点①价格昂贵②技术要求高③批-批之间有差异2/4/2023103体内药物分析固相萃取法各种方法的比较第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理固体萃取剂萃取机理被萃取物回收率选择性方便、省时性亲脂型亲脂性键合相硅胶憎水吸附较亲脂或具有较大亲脂部分结构中中很好大孔吸附树脂中中好离子交换型离子交换树脂离子交换及憎水吸附可成为带电的形式好好差亲水型硅胶硅藻土棉纤维填料表面水层与有机溶剂流动相之间的分配（硅胶可能还有吸附作用）较亲脂好中中2/4/2023104体内药物分析SPE与LLE及沉淀蛋白法的比较SPE——高提取率及高选择性，快速、简单，可自动化，应用较多LLE——两相间分配平衡时间较长萃取回收率及选择性随药物及萃取条件而变化沉淀蛋白法——快速简便、回收率高；待测物含量低时不适用

第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理2/4/2023105体内药物分析3．自动化SPE技术

优点

①节约时间，400个/hr，确保了较高的工作效率②减少了操作误差，提高准确度和精密度③安全性好，可避免人对有毒样品的接触

缺点

①残留物对测定的影响②在采用连续测定时，要考虑样品理化性质的稳定性对测定的影响第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理返回(三)样品的分离与纯化2/4/2023106体内药物分析4．固相微萃取法

（Solid-phasemicroextraction

SPME

）

SPME装置简单，类似于气相色谱微量注射器，其基本装置如图

第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理

1．压杆2．简体3．压杆卡持螺钉4．Z形槽5．简体视窗6．调节针头长度的定位器7．拉伸弹簧8．密封隔膜9．注射针管10．熔融石英纤维11．熔融石英纤维返回(三)样品的分离与纯化2/4/2023107体内药物分析SPME操作方法

固相微萃取方法分为萃取过程和解吸过程两步 ①萃取过程—具有吸附涂层的萃取纤维暴露在样品中进行萃取 ②解吸过程—将已完成萃取过程的萃取器针头插入气相色谱进样装置的气化室内，使萃取纤维暴露在高温载气中，并使萃取物不断地被解吸下来，进入后序的气相色谱分析第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理2/4/2023108体内药物分析SPME的特点

①集采样、萃取、浓集、进样于一体，避免引入多步操作误差 ②无需萃取溶剂，样品量小、空白值小 ③萃取选择性高 ④纤维涂层（萃取头）可重复用上百次 ⑤适用于分析挥发性和非挥发性物质 ⑥与GC及HPLC、MS等联用，自动化分析

目前SPME使用的固相涂层种类限制了它的应用，但该法极具前途第三章生物样品与样品制备第二节生物样品的预处理2/4/2023109体内药物分析6.

微透析技术（Microdialysis,MD）

——膜分离技术 利用膜透析原理，微量地对细胞液进行流动性连续采样的新型采样和色谱样品制备技术 微透析技术可以用来研究生物体在活动时体液组成的一些变化 微透析系统组成