第二章 发酵工业菌种选育及保藏

第二章

菌种选育、保藏与复壮2.1菌种选育目的

提高生产能力

提高产品质量

开发新产品

解决生产实际问题

防止菌种退化方法基因突变：自然选育、诱变育种基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程基因的直接进化：点突变、易错PCR、同序法DNA、Shuffling等一、菌种的来源根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买。从大自然中分离筛选新的微生物菌种。二、从自然界分离筛选新种的步骤定方案：采样：增殖：分离：纯种分离和筛选性能鉴定：菌种鉴定、发酵性能测定、毒性试验。土样采集方法森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集；水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面5～15cm处的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量无菌水中浸渍约20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分上却为根际土样。植物体采集方法

在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块，并注意不要损伤周围边缘。选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在一片叶上的取样部位。采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法相似。将洗净的根装入采样袋中，采集根系时，一般与根际土样一起保存。

水样采集方法用于细菌检测的水样应收集于100mL干净、灭菌的广口塑料瓶中。由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水层中采集水样。方法是：握住采样瓶底浸入水中30-50cm处，然后瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶。所有水样都应在24h之内迅速进行检测，或者4℃下贮存。1.稀释平皿分离法1.稀释平皿分离法100ml1g/mL9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀释1.稀释平皿分离法b.涂布平皿分离法倾注平皿分离法2.平皿划线分离法

a.连续划线分离法b.分区划线分离法1.概念：是利用微生物在一定条件下产生自发变异，通过分离、筛选、排除劣质形状的菌株，选择出维持原有生产水平或具有更优良生产性能的高产菌株。自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9。三、菌种选育（一）自然选育2.导致菌种退化变异的原因：（1）遗传基因型的分离（2）自发变异的产生（3）人工诱变导致的退化变异。3.自然选育操作步骤：

一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。单细胞(孢子)悬液的制备平板分离挑选单菌落(注意形态的观察)发酵试验（二）、诱变育种1.概念：用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种。2.诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂物理在：紫外，快中子化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍{（2）、诱变剂处理过程中几个有关的问题化学诱变剂的优缺点诱变剂量的选择诱变剂的选择出发菌株的选择（1）、诱变剂的作用原理亚硝酸：0.07MNa2HPO4亚硝基胍：1MNaOH（3）诱变剂的选择碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使用，回复突变率高，效果不大。亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为“超诱变剂”。甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺突变。但它可能影响邻近基因的性能。3、诱变育种的一般步骤出发菌株的选择处理菌悬液的制备诱变处理中间培养分离和筛选(1)出发菌株的选择自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。出发菌株开始时可以同时选2～3株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞；有的作用于休止期，就可选用孢子。

(2)处理菌悬液的制备关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。带玻璃珠的三角瓶内,加无菌水(3)诱变处理

根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。

(4)中间培养由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。此过程称为中间培养这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。

方法：让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。(5）分离和筛选筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。摇床复筛降解纤维素产生产透明圈病毒产生产空斑一、紫外线的诱变育种

紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为2537A．灯与处理物的距离为15～30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。举例

被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个/ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个

/ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.5～1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。

操作步骤

1．将细菌培养液以3000r／min离心5min，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。

2．将菌悬液放入一已灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个／ml左右，作为待处理菌悬液。

3．取2～4m1制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射10～50s。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。

4．取未照射的制备菌液和照射菌液各0.5ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。

5．取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液)，120r／min振荡培养4～6h。

6．取中间培养液稀释分离、培养。

7．挑取菌落进行筛选。二、亚硝基胍诱变曲霉菌

N—甲基—N'-硝基-N-亚硝基胍(NGN，MNNG或TG)对真核或原核微生物都有强烈的诱变作用。精确作用机制尚不清，据认为是伴随着重氮甲烷的生成及在酸性条件下生成亚硝酸，直接作用于细胞内的DNA复制系统，从而诱发了变异。

操作步骤

1．单孢子悬液制备取斜面，加入6ml0.1mol／LpH6.o的磷酸缓冲液，用接种环刮下孢子，振荡试管，立即通过带滤纸漏斗过滤，由此制得单孢子悬液。

2．MNNG溶液的制备用分析天平称取2mg，加入2ml0.1mol／LpH6.0磷酸缓冲液，于暗处振荡溶解。

3．诱变处理吸取MNNG溶液lml，加入到1m1孢子悬液中，30℃振荡30min，立即稀释1000倍停止作用，然后以10-2，10-4两个稀释度分离培养，30℃3天后计数。

4．死亡率计算将未处理的孢子液1ml加入1ml磷酸缓冲液中，同上逐级稀释分离，30℃下培养3天。根据处理前后的活孢子数可计算出死亡率。

5．挑取菌落进行糖化酶及蛋白酶产量筛选．（三）营养缺陷型的选育营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。对应的是野生型。1.与筛选营养缺陷型有关的三类培养基①基本培养基（M．M．minimal

medium）②补充培养基（S．M．

supplementalmedium）③完全培养基（C．M．

completemedium）2.筛选营养缺陷型的步骤诱变淘汰野生型检出缺陷型确定生长谱诱变方法物理诱变化学诱变淘汰野生型抗生素法：将诱变处理液在MM中培养短时间让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入一定量的抗生素，活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。菌丝过滤法：对于霉菌，孢子生长后会长出菌丝体，用滤纸过滤法将菌丝滤去，缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过。

检出缺陷型原理：缺陷型在CM上生长良好，而在MM上则不生长，野生型都能生长。具体方法：影印法、点种法、夹层法将一较平皿直径小1cm的金属圆筒蒙上一层灭菌的丝绒，用金属夹夹住，灭菌。将完全培养基上长出的全部菌落印在丝绒上，使之成为印模，标记方位。将MM平皿和CM平皿在标记的同一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。

(1)影印法恒温箱中培养。二平皿相同方位进行比较，可发现在MM平皿上长出的菌落少于CM平板。MM上未长而相应于CM上长出的那几个菌落就可能是缺陷型。要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应有一定间隔。

(2)点种法任意法。用接种针或牙签将CM上长出的菌落在MM和CM两平板上接种，依次在相应位置点种，然后一起培养，观察其生长情况。结果明确，但工作量大。

(3)夹层法先在培养皿上倒一层MM，凝固后涂上一层含菌的MM，凝固后再倒一薄层MM，培养24h，将出现的菌落标记，然后倒上一层CM，再培养。第二批长出的菌落可能是缺陷型。缺点:结果有时不明确，将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易。营养缺陷型生长谱的确定

验证确定是缺陷型后，需确定其缺陷的因子，即生长谱测定。生长谱测定的方法将缺陷型菌株培养后，收集菌体，制备成细胞悬液，与MM琼脂培养基混合并倾注平皿。凝固后，分别在平皿的5～6个区间放上不同的营养组合的混合物或其滤纸圆片。培养后会在某组合区长出菌落，就可测得所需营养。缺陷型的浓缩：①抗生素法原理：青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生长着的微生物细胞，对休止态细胞无作用。方法：将菌培养在含抗生素的MM基中②菌丝过滤法适用于：丝状（放线菌、霉菌）原理：基本培养基上只有发育成菌丝；auxo孢子可通过滤膜，野生型菌丝不能通过。①逐个检出法：（3）检出营养缺陷型：②影印实验（replicaplating）JoshuaLederbergandEstherLederberg（1952）③夹层培养法①生长谱法方法简便；回变和污染不影响结果测定物质可为粉末或纸片（4）鉴定营养缺陷型：测定一般应分两阶段：第一阶段：测定是哪类物质的缺陷型；第二节段：根据第一阶段确定的范围，进一步确定是哪种具体化合物的缺陷型；（四）基因育种基因重组育种：是运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达，或者通过细胞间的相互作用，使一个细胞的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给另一个细胞的方法。一个完整的基因克隆过程包括以下步骤１、获得待克隆的DNA片段（基因）；２、目的基因与载体在体外连接；３、重组DNA分子导入宿主细胞；４、筛选、鉴定阳性重组子；５、重组子的扩增与／或表达。基因重组（五）原生质体育种

1.原生质体融合育种的特点(1)杂交频率较高：(2)受接合型或致育型的限制较小：(3)遗传物质传递更为完整：

(4)存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能性。（5）有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株。

(6)提高菌株产量的潜力较大。

(7)有助于建立工业微生物转化体系。2、原生质体融合育种步骤（1）．标记菌株的筛选和稳定性验证。（2）．原生质体制备。（3）．等量原生质体加聚乙二醇促进融合。（4）．涂布于再生培养基，再生出菌落。（5）．选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。（6）．生产性能筛选。

3、原生质体融合育种的要点（1）标记菌种的选择采用常规诱变育种，筛选出营养缺陷型或／和抗药性菌株。

(2)原生质体的制备

在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性。放线菌和细菌——溶菌酶；酵母和霉菌——蜗牛酶或纤维素酶。

影响原生质体制备的因素菌体的前处理使酶作用的效果好一些。如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。菌体的培养时间选择增殖期的菌体。酶浓度

酶处理温度渗透压渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有机物和KCl和NaCl等无机物。（3）原生质体融合加入表面活性剂聚乙二醇，钙、镁离子等。（4）再生培养。（5）挑取融合子进一步试验、保藏。（6）生产性能筛选。（六）杂交育种1.概念：是指两个基因型不同的菌株通过接合或吻合使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。2.杂交育种的目的：获得新的具有优良性状的菌株3.杂交育种的程序（1）菌种准备原始亲本：用来进行杂交的野生型菌株，遗传基础差别要大。直接亲本菌株：直接用于进行配对的菌株，一般是原始亲本经诱变剂处理后得到的，常用的是营养缺陷型。（2）杂交育种方法（略）2.2菌种保藏与复壮理想的菌种保藏方法应具备的条件(1)

经长期保藏后菌种存活健在；(2)

保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。(3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。工业微生物菌种保藏技术

(1)冷冻干燥或真空干燥保藏；

(2)超低温或在液氮中冷冻保藏；(3)

转接培养或斜面传代保藏；

(4)土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏。一、

冷冻保藏

冷冻，使微生物代谢活动停止。通常在培养物中加入冷冻保护剂。温度-20℃以下。缺点：培养物运输较困难。冷冻保藏种类

1、普通冷冻保藏技术(-20℃)2、超低温冷冻保藏技术(-60~-80℃)3、液氮冷冻保藏技术（一）普通冷冻保藏技术(-20℃)贮藏于温度范围在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中。维持微生物活力1—2年。注意：一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏；注意控制保藏温度；密封。（二）.超低温冷冻保藏技术(-60—-80℃)长期保藏。具体方法：

(1)离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；

(2)用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；

(3)加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜；

(4)分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱中保藏。若干细菌和真菌菌种。保藏5年。（三）、液氮冷冻保藏技术

冷冻保护剂

二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚砜5％。甘油一般高压蒸汽灭菌，二甲亚砜过滤除菌。

复苏1.迅速将安瓿置于37-40℃水浴中，并轻轻摇动以加速解；2.用巴氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有无菌液体培养基的试管中，反复抽吸数次，取0.1-0.2ml转接入琼脂斜面上。二

冻干保藏

原理：通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。须使用冷冻保护剂：脱脂乳和蔗糖动物血清等。保藏10年之久。无需进行冷冻保藏，便于运输。密封。培养物的冻干过程冻干菌种的保藏与再生1．保藏：低于5℃下保藏。较低的保藏温度(-20～-70℃)对于培养物的长期稳定更好。2．复苏：启用时，拿出安瓿瓶，酒精表面消毒，无菌条件打开，加入0.3—0.5mL新鲜液体培养基溶解，移至斜面或液体培养基进行培养。三、其他保藏方法传代保藏

矿物油中浸没保藏

(一)、传代保藏将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在一定的生长温度下生长和保存的传代保藏方法。可用于实验室中若干菌种的保藏。此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的设备。但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变。因此要求在基本培养基上传代为好，目的是能淘汰突变株；同时转接菌量应保持较低水平。斜面培养物应在密闭容器中于5℃保藏，以防止培养基脱水并能降低代谢活性。此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏方法。(二）