第二章 生物催化剂的发现13

2.1概述2.2微生物酶筛选的策略2.3微生物和酶的一般筛选方法2.4优良菌种选育2.5从环境中微生物基因组DNA筛选酶的方法2.6生产用菌种的保藏2.1概述2．1．1生物催化剂的概念1生物催化剂：是生物反应过程中起催化作用的游离或固定化酶的总称。

2分类

结构形式细胞酶多细胞生物体游离型催化剂固定化催化剂酶或产酶微生物的筛选一般产酶微生物筛选的原则①能够通过发酵在相对较短的时间内高产目标酶；②微生物应该尽可能地利用便宜和方便的原料生产酶；③微生物所产生的酶最好有比较高的专一性④所采用的微生物应该是不产生有害物质的非致病性的安全微生物⑤微生物的遗传稳定性应该比较高生物催化剂筛选的主要途径

（1）从商品酶库中筛选

（2）从已知菌种来源和菌种保藏中心筛选生物催化剂

（3）从自然界发现和筛选产酶微生物

（4）从基因库筛选建立有效和方便的筛选分析方法2．2．2从极端微生物中筛选极端酶的策略极端酶（extremozyme）是由极端微生物（extremophile）产生的酶，与之相对应的中间型是常态微生物（mesophilicorganism）产生的酶。而极端微生物是在极端条件(-2～15℃，60～110℃，离子强度达5mol／LNaCl，pH＜4或pH≥9)下生存的微生物．它们所产生的酶在相应的极端条件下也具有较高的稳定性。有的极端微生物，特别是属于古细菌(Archaea)的菌种中，存在新的代谢途径，可能产生具有新的催化活力和用途的酶。经鉴定过的绝大多数极端微生物属于古细菌类，属于中间型的古细菌也有发现。2.2.3未培养生物催化剂的发现策略未培养微生物（unculturedmicroorganism）

美国微生物学家Colwell的实验室在1982年首先提出“不能培养微生物（nonculturablemicroorganism）”的概念，他们发现快速生长的霍乱弧菌和大肠杆菌移植到无营养料的盐水中，经长时期的低温保存后，细胞数不减，代谢活力不变，但在正常肉汤培养条件下不产生菌落，因此他们用“活的但不能培养（viablebutnonculturable,VBNC)”一语描述这种潜伏状态的细菌。

微生物资源研究和开发领域里的一个重大探索就是，可以采用最新的分子生物学方法，绕过菌种的分离纯化这一步骤，直接在自然界中寻找有开发价值的微生物基因。把来源于未经培养的微生物的DNA克隆到经培养驯化的宿主生物体(即可培养微生物，多用大肠杆菌)中，然后用高通量筛选技术从重组的克隆里筛选为新酶编码的基因。未培养微生物的发现又被称为分子筛选(MolecularScreening)。2．3微生物和酶的一般筛选方法2．3．1从自然界发现产酶微生物采样富集培养：是根据微生物的生理特点，在目的微生物含量较少时，设计一种选择型培养基，创造有利的生长条件，是目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣种变成人工环境下的优势种。分为分批式（摇瓶培养）和恒化式（连续培养）两种不同的方式。分离筛选（初筛和复筛）图2-2从自然界发现产酶微生物的方法富集培养方法可采用分批式（摇瓶培养）和恒化式（连续培养）两种方式。分批式培养，转种的时间是关键。恒化培养通过改变限制性基质的浓度来控制两类不同菌株的比生长速率，通过改变稀释速率进行连续富集培养，特别适合连续发酵生产。多糖产生菌的筛选:取样特点：碳水化合物工业的废弃物筛选方案：从菌落外观判断，选择外观呈粘液状的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来筛选高产菌。氨基酸产生菌的筛选

样品

预处理

初筛（除真菌）

在分离平板上生长获得多个单菌落复印平板（copy法）

平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸对应到copy前相应

u.v线杀死长好的菌落

位置，找到目的菌落

再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂

培养后

产氨基酸菌落周围有生长圈

目的菌落进行液体培养，对产物进行定量测定筛选产物含量高的菌株纯种培养一类为工业生产中应用较多的稀释涂布法、划线分离法等较为粗放的方法，只能达到“菌落纯”。另一类是单细胞或单孢子分离方法，可达到“菌株纯”或“细胞纯”。厌氧培养方法可分物理法、化学法、生物法和混合法等四类。常见的物理学方法包括煮沸法、空气置换法、气体喷射法或转管法等。化学方法包括铁丝绒法、保险粉法、药剂添加选择法及焦性没食子酸法等。生物学方法包括共生耗氧法、燕麦发芽法等。混合法有厌氧罐(袋)法。2．3．2生物催化剂的高效筛选高通量筛选（high-throughscreening,HTS）是近年来发展起来的一种新型筛选技术，其特点是微量、快速、灵敏、准确，在短时间内可以检测大量的微生物。Monica和Uwe等人用荧光标记，从而高通量地分析水解酶的合成活性。这种方法以脂肪酶和酯酶催化的乙烯酯和醇之间的转酯化反应为基础。在酯合成的过程中，由于乙烯醇的醛-烯醇异构化反应释放出乙醛，生成的乙醛继续与肼1产生荧光衍生物2，然后用荧光技术进行定量。最终用产生的乙醛浓度来定量水解酶的合成活性。2．4．1自然选育自然选育（spontaneousmutation）：未经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程。复壮：狭义的复壮是一消极措施，一般指对已衰退的菌种进行复壮；广义的复壮是一积极的措施，即在菌种的生产性状未衰退前就不断进行纯种分离和生产性状测定，以在群体中获得生产性状更好的自发突变株。多因素低剂量的诱变效应：自然界中普遍存在的一些低浓度诱变物质以及微生物自身代谢活动中所产生的一些诱变物。互变异构效应：指四种碱基的第六位上的酮基和氨基，胸腺嘧啶(T)和鸟嘌呤(G）可以酮式或烯醇式出现，胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)可以氨基式或亚氨基式出现。从而造成错误配对TG，CA；但是几率只有10-8～10-9。2．4．2诱变选育诱变育种的原理突变基因突变染色体畸变选择诱变剂的种类：在选用理化因子作诱变剂时，在同样效果下，应选用最方便的因素；而在同样方便的情况下，则应选择最高效的因素。在物理诱变剂中，尤以紫外线为最方便，而在化学诱变剂中，一般可选用诱变效果最为显著的“超诱变剂”，如亚硝基胍(NTG)。表2-2常用的各类诱变剂物理诱变剂紫外线、快中子、X射线、γ射线、激光、等离子束等化学诱变剂2-氨基嘌呤、5-溴尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤硫酸二乙酯（DES）、甲基硫酸乙酯、亚硝基乙基脲（EMS）、亚硝基甲基脲（NEU）、亚硝酸（NA）、氮芥（NM）、4-硝基喹啉（4-NQO）、乙烯亚胺（EI）、羟胺生物诱变剂噬菌体、转座子紫外线的作用机制主要是形成胸腺嘧啶二聚体以改变DNA生物活性，造成菌体死亡和变异。亚硝基胍是亚硝基烷基类化合物的一种，可诱发营养缺陷型突变，不经淘汰便可直接得到12％一80％的营养缺陷型菌株，故有超诱变剂之称。通常在浓度为300µg／mL，温度为28℃和时间为60分钟的条件下进行处理，容易得到高产菌株。

诱变育种的基本方法诱变育种诱变筛选营养缺陷型突变菌株筛选抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株筛选组成型突变菌株筛选抗性突变菌株筛选出发菌株的选择诱变剂种类和剂量的选择诱变剂使用方法的选择2．5从环境中微生物基因组DNA筛选酶的方法从土壤和水样中提取DNA土样→分离去除细菌→分离收集DNA片段→用限制酶剪切DNA→PCR扩增→克隆到（Bacterialartificialchromosome，）BAC载体内→转化培养微生物（大肠杆菌）→筛选转化株→功能基因→新酶土壤微生物DNA文库的构建

2.6生产用菌种的保藏目的：提高菌种存活率，减少菌种的变异，保持原来优良的生产性能。原理：根据菌种的生物生理、生化特点，人工地创造条件，使菌种的代谢活动处于不活泼状态，生长繁殖处于休眠状态。保藏时首先要挑选优良纯种，最好是它们的休眠体（孢子、芽孢等），其次是要创造一个最有利于休眠的环境，如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等，以达到降低其代谢活动，延长保存期的目的。

菌种保藏的方法：斜面保藏法、矿物油保藏法、砂土保管保藏法、真空冷冻干燥法、冷冻法、液态真空干燥法、琼脂穿刺封口保藏法、曲法保藏、麦粒保藏法、无水硅胶保藏法。

（1）砂土管保藏法利用土壤颗粒对微生物起保护作用，提高微生物的存活率。其包括砂土制备和真空抽干两步。适用菌种：产孢子的微生物，对于一些对干燥敏感的细菌（奈氏球菌、弧菌、假单胞杆菌）以及酵母不适用。（2）真空冷冻干燥法先在菌悬液加入保护剂（如：脱脂牛奶、血清等）然后在较低温度下使成冻结状态，最后减压抽干。

特点：它是菌种保藏中最有效的一种方法。保存期可达一年至数十年之久，并且存活率高，变异率低。单使手续麻烦，需要一定的设备。

适用菌种：对于不长孢子或长的很少孢子的真菌保藏效果不佳。曲法保藏：将麸皮与水按比例混合，灭菌后接入菌种，待孢子长成后即为成曲。将试管放入盛有氯化钙的干燥器中，干燥后低温保藏。适用于有大量孢子的霉菌和某些放线菌的保藏。麦粒保藏法：麦粒灭菌后接入菌液，培养有菌丝或孢子时，置通风、避光、干燥处保藏。适用于一些放线菌、芽孢杆菌、酵母的保藏。无水硅胶保藏法：将细胞悬浮液和等体积的脱脂灭菌牛奶混匀，加入装有无水硅胶的试管中，然后将试管放于干燥器内，室温或4℃保藏。对于细菌和真菌效果都较好。防止菌株衰退的措施菌种退化：一般都把菌株的生活力、产孢子能力的衰退和产物产量的下降统称为退化。衰退的可能原因（1）、基因突变:回复突变（2）、分离现象（3）、代谢失调菌种退化的鉴别①单位容积发酵液的酶活力单位；②琼脂平皿上的单菌落形态；③