第三章 食品微生物检验指标

第三章食品微生物

检验的指标

本章内容第一节菌落总数一、菌落总数的概念及卫生意义二、菌落总数的常规检验方法三、菌落总数的其它检验方法第二节大肠菌群MPN一、大肠菌群MPN的概念及意义二、大肠菌群MPN的常规检验方法三、大肠菌群MPN的其它检验方法第三节致病性微生物第四节霉菌和酵母菌数测定

第五节食品中的细菌菌相

重点和难点：

菌落总数卫生学意义及常规检验方法大肠菌群MPN卫生学意义及常规检验方法致病性微生物卫生学意义及常规检验方法制订食品卫生标准目的促进工农业生产、保障人体健康及维护国家的尊严和利益。意义由于食品卫生标准具有一定的社会政治性。食品卫生标准往往被用作食品贸易中类似于关税壁垒的控制手段，籍此可以“名正言顺”地限制各国所谓的不合格食品的输入，或籍此迫使出口国降价出售。

——技术贸易壁垒（TBT）第一节菌落总数一、菌落总数的概念及卫生意义二、菌落总数的常规检验方法三、菌落总数的其它检验方法第一节菌落总数一、菌落总数的概念及卫生意义1.概念菌落（colony）是指一个或几个相同的细菌在固体培养基上增殖而形成的肉眼可见的细菌集团。它是由数以万计的相同细菌聚集而成的，故又有细菌集落之称。菌落总数（colonycount）是指食品检样经过处理，在一定的条件下（样品处理、培养基成分、培养温度和时间、pH、需氧条件）培养后，所得到的每单位食品（1g，1mL，1cm2）中所含细菌菌落的总数。由于菌落总数测定是在需氧条件下进行的，而且不能区别细菌种类，因此，菌落总数又称为需氧菌数（aerobicplatecount）或杂菌数。辨析：菌落总数与细菌总数细菌总数：指一定数量或面积的食品样品．经过适当的处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数。其中包括各种活菌数和尚未消失的死菌数。细菌总数也称细菌直接显微镜数。通常以1g或1mL或lcm2样品中的细菌总数来表示。菌落总数

测定的是活菌数，现在通常用cfu/（g，mL，cm2）表示。菌落总数更具有食品卫生学意义。Why？？？第一节菌落总数一、菌落总数的概念及卫生意义1.概念2.测定意义菌落总数主要是作为判定食品被细菌污染程度的标志，也可以应用这一方法观察食品中细菌的性质以及细菌在食品中的繁殖动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供科学依据。另外，测定食品中的菌落总数也可对这种食品的质量作出预测。如菌数在105CFU/cm2的牛肉在0℃时可保存7d，而菌数为103CFU/cm2时，在上述条件下却可保存18d；有的食品当细菌数达到106~107CFU/g时，即能从感官上发现变质。有人认为，菌数达106~107CFU/g的食品即可能引起食物中毒。表3-1-1我国食品卫生标准（部分）分割鲜、冻猪瘦肉第一节菌落总数二、菌落总数的常规检验方法中华人民共和国标准GB/T4789.2-2010在GB4789.2-2010的培养条件下所得结果，只包括一群在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数。基本操作一般包括：样品的稀释；倾注平皿；培养48（24）h；计数报告。二、菌落总数的常规检验方法1.检样稀释及培养2.菌落计数方法3.菌落计数的报告

若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。（4789.2-2008，2010）

表

稀释度选择及菌落总数报告方式最新修改：2008年国标列入两种检验方法：第一法：平板菌落计数法第二法：菌落总数PetrifilmTM测试片法2010年国标删去了第二法2008年，培养基由NA改为PCA。NA：nutritionagar；PCA：Platecountagar培养基——平板计数琼脂

平板计数琼脂（PCA，2008版和2010版）

胰蛋白胨5.0g

酵母浸膏2.5g

葡萄糖1.0g

琼脂15.0g

蒸馏水1000mL营养琼脂（NA,2003版）蛋白胨10.0g

牛肉膏3.0g

氯化钠5.0g

琼脂15.0g

蒸馏水1000mL培养基改变依据：1）国外食品微生物检验的权威方法（ISO、FDA、AOAC）2）营养更优化——胰蛋白胨、酵母粉、葡萄糖

第一节菌落总数三、菌落总数的其它检验方法1.平板表面涂布法将营养琼脂制成平板，经50℃1h~2h或35℃18h~20h干燥后，于其上滴加检样稀释液0.2mL，用“L”棒涂布于整个平板的表面，放置片刻（约10min），将平板翻转，移至36±1℃温箱内培养24±2h（水产品用30℃培养48±2h）取出，按常规法进行菌落计数，然后乘以5（由0.2mL换算为1mL），再乘以样品稀释液的倍数，即得1g或1mL检样所含菌落数。2.平板表面点滴法第一节菌落总数三、菌落总数的其它检验方法1.平板表面涂布法此法较常规法为优，因菌落生长在表面，便于识别和检查其形态，虽检样中含有食品颗粒，也不会发生混淆，同时还可以使细菌免遭融化琼脂的热力伤害，不致因此而使细菌细胞受损而不生长，避免了由于操作过程中的不良因素使检验中的细菌菌落数降低。但本法取样量较常规法少，其代表性将受到一定的影响。2.平板表面点滴法第一节菌落总数三、菌落总数的其它检验方法1.平板表面涂布法2.平板表面点滴法与涂布法相似，不同的只是用标定好的微量吸管或注射器针头按滴（每滴相当于0.025mL）将检样稀释液滴加到琼脂平板上固定的区域（预先在平板背面用记号笔划成四个区域），每个区域滴1滴，每个稀释度滴两个区域，作为平行实验。滴加后，将平板放置片刻（约5min~10min），然后翻转平板，如前移入温箱中培养6h~8h后进行计数，将所得菌落数乘以40（由0.025mL换算为1mL），再乘以样品的稀释倍数，即得1g或1mL检样所含的菌落数。第二节大肠菌群MPN一、大肠菌群MPN的概念及意义二、大肠菌群MPN的常规检验方法三、大肠菌群MPN的其它检验方法第二节大肠菌群MPN一、大肠菌群MPN的概念及意义1.概念大肠菌群（coliforms）是指一大群需氧或兼性厌氧、在37℃培养24h能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。第二节大肠菌群MPN一、大肠菌群MPN的概念及意义1.概念大肠菌群并不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出来的一组与粪便污染有关的细菌。这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步的生化鉴定试验，可将大肠菌群细分为主要包括肠杆菌科的大肠埃希菌属（大肠杆菌）、枸橼酸菌属、肠杆菌属（产气杆菌属）、克雷伯菌属的一部分细菌；此外还有沙门菌属第Ⅲ亚属（能发酵乳糖），来自土壤和植物的个别细菌（如欧文菌属）。第二节大肠菌群MPN一、大肠菌群MPN的概念及意义1.概念大肠菌群（coliformgroup）大肠菌群MPN（MostProbableNumber）——为最可能数，是应用统计学原理和方法，根据试验的阳性管数计算出样品中大肠菌群的含量，报告出每1mL(g)食品中大肠菌群的最可能数。粪大肠菌群，fecalcoliformgroup——粪便来源的大肠菌群（2003国标中有检验方法，后删去）/info/46054.htm第二节大肠菌群MPN一、大肠菌群MPN的概念及意义1.概念2.意义该菌主要来源于人畜粪便，作为粪便污染指标评价食品

的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能。

??大肠菌群是作为粪便污染指示菌而提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品是否受到了人或温血动物粪便的污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，以及肠道致病菌对人体健康危害性的大小。

Why？？？第二节大肠菌群MPN一、大肠菌群MPN的概念及意义1.概念2.意义

作为粪便污染指示菌的条件：①和肠道致病菌的来源相同，并且在相同的来源中普遍存在和数量甚多，以易于检出。②在外界环境中的生存时间与肠道致病菌相当或稍长。③检验方法比较简便。最好的粪便污染指示菌是大肠杆菌。

各国根据自己的情况，有的用大肠菌群作食品受粪便污染的指标，有的使用粪大肠菌或大肠杆菌。ColiformbacteriaDefinition:arethecommonly-usedbacterialindicatorofsanitaryqualityoffoodsandwater.Theyaredefinedasrod-shapedGram-negativenon-sporeformingorganismsthatcanfermentlactosewiththeproductionofacidandgaswhenincubatedat35~37℃.Coliformsareabundantinthefecesofwarm-bloodedanimals,butcanalsobefoundintheaquaticenvironment,insoilandonvegetation.Inmostinstances,coliformsthemselvesarenotthecauseofsickness,buttheyareeasytocultureandtheirpresenceisusedtoindicatethatotherpathogenicorganismsoffecaloriginmaybepresent.Fecalpathogensincludebacteria,viruses,orprotozoa.Escherichiacoli

(E.coli)arod-shapedmemberofthecoliformgroup,canbedistinguishedfrommostothercoliformsbyitsabilitytofermentlactoseat44℃,andbyitsgrowthandcolorreactiononcertaintypesofculturemedia.WhenculturedonanEMBplate,apositiveresultforE.coliisametallicgreenmediawithdarkpurplecolonies.Unlikethegeneralcoliformgroup,E.coliarealmostexclusivelyoffecaloriginandtheirpresenceisthusaneffectiveconfirmationoffecalcontamination.Typically,E.coliareabout11%ofthecoliformsinhumanfeces.第二节大肠菌群MPN二、大肠菌群MPN的常规检验方法

第二节大肠菌群MPN二、大肠菌群MPN的常规检验方法

1、检样稀释：以无菌操作，将检样25g（或25mL）剪碎放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（内置适量玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体样品在加入稀释液后，最好置均质器中以8000r/min~10000r/min的速度处理1min，做成1:10的均匀稀释液。根据国家或当地卫生标准要求及对样品污染程度的估计，连续做几个10倍递增稀释，并选择3个连续的稀释度，用于接种乳糖胆盐发酵管。

一)第二节大肠菌群MPN二、大肠菌群MPN的常规检验方法1、检样稀释2、乳糖发酵试验：接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；1mL及1mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。选择3个稀释度，每个稀释度接种3管乳糖胆盐发酵管，置于36±1℃培养48±2h，观察是否产气。不产气的管报告为大肠菌群阴性。

3、分离培养4、证实试验5、报告第二节大肠菌群MPN二、大肠菌群MPN的常规检验方法1、检样稀释2、乳糖发酵试验3、分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18~24h，观察菌落形态。典型的大肠菌群菌落呈紫黑色并带有金属光泽或无光泽，而红色、粉红色菌落检出率较低。

4、证实试验5、报告第二节大肠菌群MPN二、大肠菌群MPN的常规检验方法1、检样稀释2、乳糖发酵试验3、分离培养4、证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色镜检。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。凡乳糖发酵管产气、镜检为革兰氏染色阴性的无芽孢杆菌者，即可报告为大肠菌群阳性。5、报告第二节大肠菌群MPN二、大肠菌群MPN的常规检验方法1、检样稀释2、乳糖发酵试验3、分离培养4、证实试验5、报告：根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN表（见表3-2-1），报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。根据试验的阳性管数计算出样品中大肠菌群的含量，报告出每100mL(g)大肠菌群的最可能数。具体操作参见GB4789.3-2003《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》。大肠菌群检验程序（2003）

大肠菌群检验第一法：MPN计数（2008，2010）第二节大肠菌群MPN二、大肠菌群MPN的常规检验方法

二)大肠菌群检验第二法：平板计数法（2008，2010）第二节大肠菌群MPN二)关于培养基LST肉汤是国际上通用的培养基，与乳糖胆盐发酵培养基的作用相同，但更具优越性：LST中的抑菌剂是月桂基硫酸盐，比胆盐稳定性好，更容易观察。BGLB肉汤用于乳糖发酵确证试验抑制剂：煌绿，也叫做亮绿；牛胆盐，抑制革兰氏阳性菌生长。抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有误差，即可对抑菌作用产生影响，因此添加时应严格按照标准方法进行。

大肠菌群：紫红色菌落，周围有胆酸盐沉淀；

沙门菌和志贺菌：无色菌落。原理：乳糖作为可发酵碳源；胆盐和结晶紫抑制革兰阳性菌生长；中性红为酸碱指示剂

临用前配制！每皿倾注15-20mL，凝固后再加3-4mL覆盖（防止蔓延生长）第二节大肠菌群MPN三、大肠菌群MPN的其它检验方法1.疏水网膜法（hydrophobicgrid-membranefilter,HGMF）加拿大的SharpAN博士等(1974)首次报道。其基本原理是：以疏水物质在5cm2、孔径为0.45µm的滤膜上，横竖各刻印40条线，将滤膜分为1600个小格，以疏水线作为栅栏，防止菌落扩散。样品稀释液首先通过5µm的前滤器过滤，再通过0.45µm的HGMF滤膜过滤，然后根据所需检验菌的特性，将滤膜置于不同的选择培养基上培养24h~48h，阳性菌落即可通过显色而进行鉴定，如果是大肠菌群则呈蓝色。根据阳性菌落数查“阳性菌落数与单位生长最近似值换算表”即可得出单位样品中大肠菌群的MPN。2.TTC显色法3.DC半固体试管法4.纸片法

第二节大肠菌群MPN三、大肠菌群MPN的其它检验方法1.疏水网膜法

本法可在24h~30h得出结果，大肠菌群准确率为100%，无假阳性。该法的优点在于：只使用单一的稀释度，大大减少了检验过程中的随机误差和系统误差；在过滤时除掉了所含的一些固体物质，及一些不利于细菌生长的可溶性物质，便于细菌的生长；因为滤膜先在营养琼脂上培养4h~5h，再转移到选择性培养基，使受伤细菌得以恢复，因此缩短了检出时间，提高了灵敏度。2.TTC显色法3.DC半固体试管法4.纸片法第二节大肠菌群MPN三、大肠菌群MPN的其它检验方法1.疏水网膜法

2.TTC显色法

该法使用的是含有TTC（氯化三苯四氮唑）的乳糖发酵培养基，接种方法与常规法相同。接种后于35℃~37℃培养18h~24h，观察TTC乳糖培养基的显色和产气现象来判断大肠菌群，然后根据阳性管数，查大肠菌群MPN检索表，报告大肠菌群数。

3.DC半固体试管法4.纸片法第二节大肠菌群MPN三、大肠菌群MPN的其它检验方法1.疏水网膜法

2.TTC显色法3.DC半固体试管法该法是将检样稀释成3个稀释度，分别接种于含有DC（去氧胆酸钠）的半固体培养基中，充分混合，待凝固后，放入37℃温箱内培养18~24h，根据培养基的颜色和有无气泡的产生或琼脂崩裂现象来判断大肠菌群，并根据阳性管数查MPN检索表报告大肠菌群数。

4.纸片法第二节大肠菌群MPN三、大肠菌群MPN的其它检验方法1.疏水网膜法

2.TTC显色法3.DC半固体试管法

4.纸片法该法是将含有溴甲酚紫和TTC成分的培养基浸渍纸片，然后将稀释成三个不同稀释度检样分别涂布在三张纸片上，置36±1℃温箱中培养15h，根据纸片上菌落颜色和菌落周围纸片颜色来判断大肠菌群，并根据纸片的阳性片数，查大肠菌群MPN检索表进行报告。纸片法目前，大肠菌群检测纸片已在全国各地疾病预防控制中心实验室广泛应用，食(饮)具大肠菌群纸片检测法已被列为中华人民共和国国标。据报道，该方法和九管法检测结果的总符合率为94.5％。其他方法：coliformbacteriatestkit.pdf3M测试片法以Petrifilm为载体的测试片：美国3M公司发明的一种用于菌落计数的可再生的水合物干膜，由上下两层薄膜组成，下层的聚乙烯薄膜上印有网格并且覆盖有培养基，上层是聚丙烯薄膜。培养基中含有微生物生长及生化试验所需的营养及试剂，并通过一种冷水可溶性的凝胶剂附着在上下两层膜上。生化试剂有特异性显色物质和抗生素。待测样品处理后不需要增菌，直接接种纸片，适宜温度培养后计数。Patrifilm纸片已经通过多个国际组织的认可。测试片法与传统方法相比在统计学上无显著性差异大肠菌群、大肠杆菌检3M测纸片该测试片含有改良的VRB(VioletRedBile)培养基及葡萄糖苷酸酶指示剂。绝大多数大肠杆菌能产生beta-葡萄糖苷酸酶，与培养基中的指示剂反应，产生蓝色沉淀环绕在大肠杆菌菌落周围，表面覆盖的胶膜，可留住发酵乳糖产生的气体，形成蓝色和深蓝色的菌落并有气泡相连。大肠菌群菌落在测试片上产酸，pH指示剂使培养基变为暗红色，在红色菌落周围有气泡者为大肠菌群。所以，一次测试即可测出大肠杆菌和大肠菌群数：带气泡的蓝色和红色菌落为大肠菌群，带气泡的蓝色菌落为大肠杆菌。第三节致病性微生物

食品首先要求的是安全性，其次才是可食用性及其它。因此，食品中一旦有致病菌污染，其安全性就丧失了，食用性也就不复存在。致病菌与食品中毒和疾病发生是肯定和直接的。致病菌污染的食品不但对个人健康造成危害，对家庭和社会也会造成一定的危害。各国卫生部门都对致病菌作了严格规定，把致病菌作为食品卫生质量的最重要的指标。根据我国食品卫生标准规定，在所有食品中各相关致病菌不得检出。第三节致病性微生物一、食品中存在的常见致病菌

食品生产是一个时间长、环节多的复杂过程。总之，与食品有直接和间接关系的致病性微生物都可能污染食品。有时引起人类食物中毒的并不是致病菌本身，而是由它们所产生的外毒素或内毒素，也包括一些真菌等。1、能引起人类疾病和食物中毒的致病性微生物：沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌、副溶血性弧菌，口蹄疫病毒等。2、能产生毒素并引起食物中毒的微生物：肉毒梭菌、葡萄球菌和产气荚膜杆菌，也包括一些真菌，都会产生毒素。第三节致病性微生物二、食品中致病性微生物的检验根据每种食品最可能污染的致病菌种类进行检验，如肉、蛋类食品以沙门氏菌检验为主，罐头制品以肉毒梭菌及其毒素检验为主，牛乳以结核杆菌和布氏杆菌为主，而水产品必须检验副溶血弧菌等。目前列入食品卫生国家标准的致病菌有13种，每种都有完整、详细的检验方法（03年新国标）。这些检验方法符合我国国情，同时与一些发达国家的检验方法基本上一致。特别说明在加工食品中，存活下来的致病性微生物往往受到了某种程度的损伤，不易检测出来。因此，需要进行前增菌，以帮助致病菌恢复到正常状态。前增菌的方法和所用培养基因食品的理化性质、加工方法而异。比如，检验沙门菌时，干蛋品用缓冲蛋白胨水进行前增菌，脱脂乳粉用煌绿水进行前增菌，全脂乳粉则用灭菌蒸馏水进行前增菌，椰子粉用乳糖肉汤，干酵母用胰酪胨大豆肉汤前增菌。第四节霉菌和酵母计数一、霉菌和酵母的食品卫生学意义二、检验第四节霉菌和酵母计数一、霉菌和酵母的食品卫生学意义霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为食品正常菌相的一部分。某些霉菌和酵母的利用。在某些情况下，霉菌和酵母在食品中生长也可使食品腐败变质。还可破坏食品的色、香、味，使食品产生不良气味、颜色改变等。pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品中；低温贮藏食品；含有抗菌素而不适于细菌生长的食品。霉菌和酵母能合成有毒的代谢产物（霉菌毒素），可引起急性或慢性食源性疾病；黄曲霉毒素等霉菌毒素具有强烈的致癌性；或能促进病原菌生长。因此，霉菌和酵母也可作为评价食品卫生质量的指标之一，以霉菌和酵母菌数判断食品的污染程度。目前已有一些国家对某些食品制定了霉菌和酵母数的限量标准。第四节霉菌和酵母计数二、检验（见国家标准GB4789.15—2010）平板计数法主要采用倾注培养菌落计数，方法和要求与细菌菌落总数测定相同，区别之处主要如下。（1）倾注培养用的培养基必须适合霉菌生长，而对细菌具有抑制作用。常用的选择培养基为孟加拉红（虎红）培养基、高盐察氏培养基或马铃薯-葡萄糖琼脂。（2）培养温度为25℃~28℃，3d后开始观察，共培养观察7d。（3）霉菌的菌落比较大，在计数时选择菌落数在30~100个之间的平板进行。（4）样品稀释时，要用带橡皮乳头的1mL灭菌吸管反复吹打50次，使霉菌孢子充分散开。第四节霉菌和酵母计数二、检验平板计数法

附录：霉菌直接镜检计数法（适用于番茄酱罐头）（1）检样的制备：取定量检样，加蒸馏水稀释至折光指数为1.3447~1.3460（即浓度为7.9%~8.8%）备用。（2）显微镜标准视野的校正：将显微镜按放大率90~125倍调节标准视野，使其直径为1.382mm。检查标准视野：将载玻片放在载物台上，配片置于目镜的光栏孔上，然后观察。标准视野要具备两个条件：载玻片上相距1.382mm的两条平行线与视野相切；配片（测微器）的大方格四边也与视野相切。如果发现上述两个条件其中有一条不符合，须经校正后再使用。第四节霉菌和酵母计数二、检验霉菌直接镜检计数法

（3）涂片：洗净霍华德计测玻片，将制好的标准样液，用玻棒均匀地摊布于计测室，以备观察。涂好的制片，在计测室内，每个标准视野的样液体积为0.15mm3。（4）观测：将制好的载玻片放于显微镜标准视野下进行霉菌观测，一般每1个检样应观察50个视野，最好同一检样由2人进行观察。所检查的50个视野要均匀地分布在计测室上。第四节霉菌和酵母计数二、检验霉菌直接镜检计数法

（5）结果与计算：在标准视野下，发现有霉菌菌丝且其长度超过标准视野（1.382mm）的1/6（即测微器的1格）或3根菌丝总长度超过标准视野的1/6时即为阳性（+），否则为阴性（–）。按100个视野计，其中发现有霉菌菌丝体存在的视野数，即为霉菌的视野百分数。霉菌的视野百分数（霉菌数）：用百分比表示，