菌种的复壮与保藏(陈)

第三章菌种的衰退、复壮与保藏第一节菌种的衰退和复壮一、菌种的衰退

菌种衰退（degeneration）是指菌种经过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。（一）菌种衰退的具体表现1、菌落和细胞形态改变。每一种微生物在一定的培养条件下都有一定的形态特征，如果典型的形态特征逐渐减少，就表现为衰退。2、生长速度缓慢，产孢子越来越小。3、代谢产物生产能力的下降，即出现负突变。4、致病菌对宿主侵染能力下降。5、对外界不良条件（包括低温、高温或噬菌体侵染等）抵抗能力的下降等。总之，退化是发生在群体细胞中的一个从量变到质变的逐步演变过程，由于个别突变细胞表现生长优势，导致在群体中最后数量占优势。（二）菌种衰退的原因1、基因突变（1）有关基因发生负突变导致菌种衰退菌种衰退的主要原因是有关基因的负突变。（2）表型延迟造成菌种衰退如，在诱变育种过程中，经常会发现某菌株初筛时产量较高，进行复筛时产量却下降了。（3）质粒脱落导致菌种衰退质粒脱落导致菌种衰退的情况在抗生素生产中较多，不少抗生素的合成是受质粒控制的。2、连续传代连续传代是加速菌种衰退的一个重要原因。一方面，传代次数越多，发生自发突变（尤其是负突变）的几率越高；另一方面，传代次数越多，群体中个别的衰退型细胞数量增加并占据优势越快，致使群体表型出现衰退。3、不适宜的培养和保藏条件不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重要原因。不良的培养条件如营养成分、温度、湿度、pH值、通气量等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等，不仅会诱发衰退型细胞的出现，还会促进衰退细胞迅速繁殖，在数量上大大超过正常细胞，造成菌种衰退。（三）菌种衰退的防治1、控制传代次数

即尽量避免不必要的移种和传代，将必要的传代降低到最低限度，以减少自发突变的机率。2、创造良好的培养条件

1)结构类似物抗性菌株在保藏培养基中应添加相应药物，及时淘汰回复突变细胞。

2)基因工程菌添加抗生素于培养基中防止质粒的丢失。

3）培养营养缺陷型菌株时应保证适当的营养成分，尤其是生长因子。

4）控制好碳源、氮源等培养基成分和pH、温度等培养条件，使之有利于正常菌株生长，限制退化菌株的数量，防止衰退。3、利用不易衰退的细胞移种传代

在放线菌和霉菌中，由于它们的菌丝细胞常含几个细胞核，甚至是异核体，因此用菌丝接种就会出现不纯和衰退，而孢子一般是单核的，用它接种时，就不会发生这种现象。另外，有些霉菌（如构巢曲霉）若用其分生孢子传代就易衰退，而改用子囊孢子移种则能避免衰退。4、采用有效的菌种保藏方法有效的菌种保藏方法是防止菌种衰退极其必要的措施。在实践中，应当有针对性的选择菌种保藏的方法。例如，酿酒酵母，保持其优良发酵性能最有效的保藏方法是－70℃低温保藏，其次是4℃低温保藏，而冷冻干燥保藏法和液氮保藏法并不理想。短期保藏——一般斜面冰箱保藏法长期保藏——砂土保藏法、冷冻干燥保藏法及液氮保藏法等方法。对于比较重要的菌种，尽可能采用多种保藏方法。5、讲究菌种选育技术

在菌种选育时，应尽量使用单核细胞或孢子，并采用较高剂量使单链突变而使另一单链丧失作为模板的能力,避免表型延迟现象。同时，在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化，以保证菌种的纯度。6、定期进行分离纯化定期进行分离纯化，对相应指标进行检查，也是有效防止菌种衰退的方法。

二、菌种的复壮侠义的复壮：菌种已经发生衰退后，再通过纯种分离和性能的测定等方法，从衰退的群体中找出尚未衰退的少数个体，以达到恢复该菌种原有典型性状的一种措施。广义的复壮：一种积极的措施，即在菌种的生产性能尚未衰退前经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，使菌种地生产性能逐步提高。纯种分离法寄主体内复壮法淘汰法遗传育种法复壮措施方法1、纯种分离法

通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可恢复原菌株的典型性状。“菌落纯”的水平——稀释平板法、涂布平板法、平板划线法等方法获得单菌落。“细胞纯”即“菌株纯”的水平——培养皿或凹玻片等作分离室的方法、显微操纵器的纯种分离法。2、宿主体内复壮法对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应昆虫或动植物宿主体内来提高菌株的毒性。例如：苏云金芽孢杆菌——感染菜青虫的幼虫，然后再从病死的虫体内重新分离典型菌株。根瘤菌属——回接到相应豆科宿主植物上,令其侵染结瘤,再从根瘤中分离出根瘤菌,其结瘤固氮性能就可恢复甚至提高。3、淘汰法将衰退菌种进行一定的处理（如药物，低温、高温等），往往可以起到淘汰已衰退个体而达到复壮的目的。例如：有人曾将“5406”的分生孢子在低温(－10～30℃)下处理5～7d，使其死亡率达到80％，结果发现在抗低温的存活个体中留下了未退化的健壮个体。4、遗传育种法即把退化的菌种，重新进行遗传育种，从中再选出高产而不易退化的稳定性较好的生产菌种。第二节菌种的保藏一、理想的菌种保藏方法应具备的条件1

经长期保藏后菌种存活健在；2

保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。3菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。世界上国际知识产权组织承认的法定保藏机构有28家。Ex：美国的标准菌种保藏所（ATCC）美国农业部农业研究服务部（ARS）英国国立标准菌种保藏所（NCTC）我国：中国科学院微生物研究所的普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）武汉大学的中国典型培养物保藏中心

（CCTCC）二、微生物菌种保藏技术

原理：根据微生物的生理生化特性，人为地创造条件，使孢子或菌体处于代谢不活泼，生长繁殖受到抑制的休眠状态，以减少菌种的变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平，缺氧状态，干燥和低温等。斜面保藏法穿刺保藏法石蜡油封藏法沙土管干燥保藏法真空冷冻保藏法液氮保藏法悬滴保藏法低温保藏法麸皮保藏法斜面保藏法接种适宜斜面培养基→培养→4℃保藏适用：各大类保藏期：3~6个月缺点：保存期短，传代多，易退化

点接：把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。中央划线：从斜面中央自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。密波状蜿蜒划线法:从斜面底部自下而上划密“之”字形线。能充分利用斜面获得大量菌体细胞，适用于细菌和酵母菌等。挖块接种法:挖取菌丝体连同少量培养基，转接到新鲜斜面上。适用灵芝等担子菌类真菌。斜面接种法培养：

将接种后的培养基放入培养箱中，在适宜的条件下培养至细胞稳定期或得到成熟孢子。细菌培养温度一般为30～37℃，真菌培养温度一般为25～28℃。保藏：培养好的菌种于4～6℃保存，根据要求每3～6个月移植一次。某些菌种，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，须1～3个月移植一次。保藏湿度用相对湿度表示，通常为50%～70%。斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意外和污染造成损失。

半固体穿刺保藏法穿刺接种适宜半固体→培养→4℃保藏适用：细菌，酵母等保藏期：6~12个月

用接种针从原菌种斜面上挑取少量菌体，从柱状培养基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底），然后沿原穿刺途径慢慢抽出接种针。石蜡油封藏法措施：阻隔了空气，使菌体处于缺氧状态下，而且又防止了水分挥发。方法：液体石蜡150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸汽灭菌60～80min，再置于80℃的烘箱内烘干除去水分→倒入菌种管中（高出1cm）→4℃保存。适用：霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等保藏期：1～2年，或更长

砂土管干燥保藏法措施：无营养，缺氧，干燥方法：孢子或芽孢悬液→加入无菌砂土管中→干燥→封口→5℃保藏适用：产孢子的丝状真菌、放线菌；有芽孢的细菌保藏期：1~10年或更长河沙60目筛弃去大颗粒及杂质80目筛去掉细沙吸铁石吸去铁质10％～20％的盐酸浸泡24h去除有机物水洗至中性烘干或晒干土：取地面下40～60cm非耕作层贫瘠且粘性较小的土，研碎，100目过筛,水洗至中性，烘干。

将处理后的沙、土按质量比2∶1混合。混匀的沙土分装入安瓿管或小试管中，高度为1cm左右，塞好棉塞，121℃湿热灭菌30min。沙土管制作沙：向培养好的斜面培养物中注入3～5mL无菌水，洗下细胞或孢子制成菌悬液。用无菌吸管吸取菌悬液，均匀滴入沙土管中，每管0.2～0.5mL。放线菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。真空抽去沙土管中水分。将沙土管用火焰熔封后存放于低温(4～6℃)干燥处保藏，每隔半年检查一次菌种存活性及纯度。或将沙土管直接用牛皮纸或塑料纸包好，置干燥器内保存。保藏时间2～10年。无菌条件下打开沙土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。或取沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面。沙土管恢复培养真空冷冻干燥保藏法：措施：低温、干燥，缺氧，保护剂方法：菌种培养→用保护剂悬浮→加入安醅管中→低温冻结（-25~-40℃）→抽真空→真空封口→4-5℃保藏适用：各大类（不产孢子的丝状真菌除外）保藏期：5~10年或更长常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。复苏方法：——先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，——将安瓿管顶部烧热，——用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，——用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养。安培瓶冻干机

液氮超低温保藏法措施：低温、加保护剂（10%甘油、DMSO）方法：菌悬液→加入保护剂→分装至安醅管中（0.2-1cm菌悬液）→逐步降温至-35℃→液氮罐保藏适用：范围广泛保藏期：一般2～3年，长则15年。常用保护剂有甘油、二甲基亚砜、糊精、血清蛋白、聚乙烯氮戊环、吐温80菌种的准备可采用下列几种方法：刮取培养物斜面上的孢子或菌体，与保护剂混匀后加入冻存管内；接种液体培养基，振荡培养后取菌悬液与保护剂混合分装于冻存管内；将培养物在平皿培养，形成菌落后，用无菌打孔器从平板上切取一些大小均匀的小块（直径约5-10毫米），真菌最好取菌落边缘的菌块，与保护剂混匀后加入冻存管内；在小安瓿管中装1.2-2毫升的琼脂培养基，接种菌种，培养2-10天后，加入保护剂，待保藏。复苏方法：从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。菌种冻存管悬滴保藏法措施：无营养，悬浮，溶液方法：寡营养保藏，放置10℃或室温适用：丝状真菌、酵母、肠道细菌保藏期：1年或更长低温保藏法方法：-20℃适用：无芽孢厌气菌，放线菌等保藏期：1