微生物学-5生长

第五章微生物的生长及控制个体生长——微生物细胞的重量和体积不断增大的过程。个体繁殖——微生物细胞产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。群体生长——群体中个体数目和重量的增加。可以用重量、体积、密度或浓度来衡量。

群体生长=个体生长+个体繁殖生长与繁殖的概念单个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代。对于微生物，由于其主要进行无性f繁殖，故纯培养即为克隆。建立纯培养，证实其纯度无可置疑并保

持不受污染是微生物学家最重要的任

务之一。纯培养（pureculture）：第一节微生物的纯培养用固体培养基分离纯培养用液体培养基分离纯培养单孢子或单细胞分离法利用选择性培养基分离法一、用固体培养基分离纯培养（菌落分离法）1.平板划线分离法

用接种环以菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。分区划线（适用于浓度较大的样品）

连续划线（适用于浓度较小的样品）分段划线和连续划线2.稀释倒平板法3.涂布平板法简单易行，但易造成机械损伤涂布平板法连续稀释,目的是使一支试管中分配不到一个微生物。适合于优势微生物.二、用液体培养基分离纯培养（液体稀释法）三、单孢子或单细胞分离法采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。在显微镜下使用单孢子分离器进行机械操作，挑取单孢子或单细胞进行培养。也可以采用特制的毛细管在载玻片的琼脂涂层上选取单孢子并切割下来，然后移到合适的培养基进行培养。四、选择性培养基分离法为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。＊利用选择培养基进行直接分离＊富集培养微生物纯培养分离方法的比较分离方法应用范围平皿划线法方法简便，多用于分离细菌稀释倒平皿法即可定性，又可定量，用途广泛单细胞挑取法局限于高度专业化的科学研究利用选择培养基法适用于某些生理类型较特殊的微生物第二节微生物生长的测定评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果；客观地反映微生物生长的规律；评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；微生物生长微生物生长测量方法计数法重量法生理指标法一、计数法1直接法（全数法）1）血球板法优点：快捷、简便缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；用于单细胞微生物血球计数板法原理：将1cm2×0.1mm的薄层空间划分为400小格，从中均匀分布地选取80或100小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。血球计数板法2）比浊法在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比。特点：快速、简便；但易受干扰。2间接法（活菌计数法）

1）2）薄膜过滤计数法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。 将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。二、重量法总氮测定法测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法直接法干重湿重间接法DNA含量测定法三、生理指标测定法样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。常用于对微生物的快速鉴定与检测微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相关。第三节微生物的生长规律一、细菌群体生长规律（典型生长曲线）两个定义生长曲线分批培养分批培养：指微生物在一定容积的培养基中，在特定培养条

件下只完成一个生长循环（最后一次收获）的培

养方法。（封闭系统）连续培养：指微生物在整个生长时间，以一定的方法（恒浊、

恒化）使微生物持续的以较恒定的生长速率生长

的培养方法。（开放系统）生长曲线：

将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的液体培养基中，在适宜条件下培养，定时取样，测菌量。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。细菌纯培养群体生长测定根据微生物生长速率常数（每小时的分裂代数）的不同，可分为迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期。生长曲线可分：延迟期对数期衰亡期稳定期其它名称：停滞期、调整期现象：曲线平行于横轴特点：生长速率常数=0形态变大合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快）对不良条件敏感（如氯化钠、温度、抗生素等）原因：适应环境，调整代谢1延迟期◆菌种：繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短◆接种物菌龄：用对数生长期的菌种接种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟期；◆接种量：一般来说，接种量增大可缩短甚至消除延迟期（发酵工业上一般采用1/10的接种量）；◆培养基成分：

在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；

接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。★影响延迟期长短的因素：对实践的指导意义：◆在发酵工业上需尽量缩短延迟期；①增加接种量；（群体优势----适应性增强）②采用对数期的菌种；③调整培养基◆在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌2对数期其他名称：指数期现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。特点：生长速率常数最大，即代时最短细胞进行平衡生长（菌体大小、形态、生理特征等比较一致）代谢最旺盛对理化因素较敏感影响因素：菌种；营养成分；营养物浓度﹡培养温度应用意义：①生产上用作接种的最佳菌龄；②发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度③食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期④是生理研究或进行染色、形态观察等的良好材料3稳定期又称：恒定期或最高生长期特点：①生长速率处于动态平衡。②分裂速度下降，开始积累内含物，产芽孢的细菌开始产芽孢。③开始合成次生代谢产物。产生原因：

营养物耗尽营养物比例失调代谢废物的积累（酸、醇、毒素等）物化条件不合适（pH、氧化还原势等）应用意义：发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下：补充营养物质（补料）调pH

调整温度4衰亡期特点：①出现“负生长”。②细胞内颗粒更明显，细胞出现畸形或衰退形，芽孢释放。产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡二、同步培养

1.概念同步培养(synchronousculture)：是一种培养方法，它能使群体中不同步的细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞。同步生长：以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段，并同时进行分裂的生长方式同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。同步培养方法机械方法环境条件控制技术离心方法过滤分离法硝酸纤维素滤膜法温度培养基成份控制光照和黑暗交替培养硝酸纤维素滤膜法离心法三、连续培养

连续培养(continouscultureofmicroorganisms)是在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。

连续培养的基本原则：微生物培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物连续培养类型恒浊连续培养恒化连续培养无菌培养基储备器控制系统培养装置收集器通气、搅拌装置(一)恒化连续培养在整个培养过程中通过控制培养基中某种营养物质的浓度基本恒定（低）的方式，保持细菌的比生长速率恒定，使生长“不断”进行。生长速率的控制因子：一般是氨基酸、氨和铵盐等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐，生长因子等物质恒化器连续培养通常用于微生物学的研究工作，如筛选不同的变种、模拟自然条件等。生长限制因子：凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量的营养物就称生长限制因子(二)恒浊连续培养通过连续培养装置中的光电系统控制培养液中菌体浓度恒定、使细菌生长连续进行的一种培养方式。用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业(三)连续发酵与单批发酵相比优点：缩短发酵周期，提高设备利用率；便于自动控制；降低动力消耗及体力劳动强度；产品质量较稳定；缺点：杂菌污染和菌种退化第四节环境因素对微生物的影响影响因素：氧温度PH值影响表现：影响酶活性影响细胞膜的流动性影响物质的溶解度一、温度（一）微生物生长的三个温度基点最低生长温度：微生物生长的最低温度下限；最高生长温度：微生物生长的最高温度；最适生长温度：微生物生长最快时的温度1）最适温度不等于积累代谢产物的最佳温度；2）同类型发酵使用菌种不同，最适温度不同；3）同一微生物不同生理活动的最适温度不同。根据微生物的最适生长温度的不同，可将微生物划为三个类型：（二）微生物生长温度类型低温型微生物（嗜冷微生物）中温型微生物（嗜温微生物）高温型微生物（嗜热微生物）

微生物类型

生长温度／℃最低最适最高嗜冷微生物0以下1520兼性嗜冷微生物020-3035；嗜温微生物15-2020-4545以上嗜热微生物4555-6580超嗜热或嗜高温微生物6580-90100以上应用

低温：速冻加保护剂，用于菌种保藏

干热法

高温用于消毒灭菌

湿热法理化因素的影响—温度微生物对氧的需要和耐受力在不同的类群中变化很大，根据微生物与氧的关系,可把它们分为几种类群:

专性好氧菌:好氧菌

微好氧菌：兼性厌氧菌耐氧厌氧菌：

厌氧菌

(专性)厌氧菌：二、氧气氧浓度对不同微生物生长的影响在氧还原为水的过程中，可形成某些有毒的中间产物，例如，过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（O2·

）等。超氧阴离子为活性氧，兼有分子和离子的性质，反应力极强，极不稳定，可破坏膜和重要生物大分子，对微生物造成毒害或致死。好氧微生物具有降解这些产物的酶，如过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等。而严格厌氧菌缺乏SOD，故易被生物体内极易产生的超氧阴离子自由基毒害致死。厌氧菌的氧毒害机制——SOD学说：各类菌所含对氧解毒酶

专性好氧菌SOD，过氧化氢酶兼性厌氧菌SOD，过氧化氢酶专性厌氧菌二种酶均无微好氧菌少量SOD耐氧菌SOD，过氧化物酶◆影响膜表面电荷的性质及膜的通透性◆改变酶活、酶促反应的速率及代谢途径如：酵母菌在pH4.5-5产乙醇，在pH6.5以上产甘油、酸。◆影响培养基中营养物质的离子化程度三、pH（一）影响表现：微生物生长的pH值三基点：各种微生物都有其生长的最低、最适和最高pH值。低于最低、或超过最高生长pH值时，微生物生长受抑制或导致死亡。（二)不同微生物对pH要求不同

微生物最低PH最适PH最高PH细菌3-56.5-7.58-10酵母菌2-34.5-5.57-8霉菌1-34.5-5.57-8（三）微生物的生命活动对环境pH值的影响★微生物在生长过程中也会使外界环境的pH值发生改变：由于有机物分解：分解糖类、脂肪等，产生酸性物质，使培养液pH值下降；分解蛋白质、尿素等，产生碱性物质，使培养液pH值上升由于无机盐选择性吸收：铵盐吸收（(NH4)2SO4H2SO4），pH↓硝酸盐吸收(NaNO3NaOH)，pH↑★培养过程中调节pH值的措施过酸时：加入碱或适量氮源，提高通气量。过碱时：加入酸或适量碳源，降低通气量。NH4+被吸收NO3+被吸收★配制培养基时调整pH值的措施：第五节微生物生长繁殖的控制一基本概念防腐(antisepsis)：在某些化学物质或物理因子作用下，能防止或抑制微生物生长的一种措施消毒(disinfection)：利用某种方法杀死或灭活物质或物体中所有病原微生物的一种措施灭菌(sterilization)：指利用某种方法杀死物体中包括芽孢在内的所有微生物的一种措施化疗(chemotherapy)：利用具有选择毒性的化学物质如磺胺、抗生素等对生物体内部被微生物感染的组织成病受细胞进行治疗，以杀死组织内的病原微生物或病变细胞，但对机体本身无毒害作用的治疗措施。二控制微生物的物理因素

温度辐射作用过滤渗透压干燥超声波（一）温度★干热灭菌法（dryheatsterilization）焚烧法（incineration）：是将被灭菌物品在火焰中燃烧，使所有的生物质碳化。简单、彻底，但对被灭菌物品的破坏极大。适用于无经济价值的物品灭菌，及不怕烧的实验器具，如接种环、镊子、试管或三角瓶口的灭菌等。干燥热空气灭菌法(hot-airoven)：将物品放入烘箱内，然后升温至150℃—170℃，维持1—2小时。适用于玻璃、陶瓷和金属物品的灭菌，不适合液体样品，及棉花、纸张、纤维和橡胶类物质的灭菌。特点：由于空气传热穿透力差，菌体在脱水状态下不易杀死，所以温度高、时间长。

★湿热法(moistheatsterilization)

：特点：温度低、时间短、灭菌效果高原因：

1)菌体内含水量越高，则凝固温度越低；

2)蒸汽冷凝会放出潜热；

3)饱和水蒸汽穿透力强；

4)湿热易破坏细胞内蛋白质大分子的稳定

性，主要破坏氢键结构。高压蒸汽灭菌法利用水的沸点随水蒸气压力的增加而上升，以达到100℃以上高温灭菌的方法。方法：121℃（1kg/cm2或15磅/英寸2）维持15-20min。

112℃（0.5kg/cm2或8磅/英寸2）20-30min。

115℃（0.75kg/cm2或11磅/英寸2）20-30min。应根据灭菌物品的性质或成分选择灭菌温度例如：生理盐水、营养琼脂等培养基用121℃。含葡萄糖、乳糖、氨基酸等培养基用112℃。适用：耐高温物品，玻璃仪器、含水或不含水的物品。高压蒸汽灭菌锅注意事项：排净冷空气；灭菌终了，缓慢降压；灭菌结束，趁热取出物品。高温对培养基的影响及其防止措施高温对培养基的不利影响：▲会产生混浊或形成不溶性沉淀▲营养成分被破坏（PO4-3存在，葡萄糖生成酮糖，菌不利用）；▲色泽加深（褐变如产生氨基糖等）；▲改变培养基的pH值（通常下降0.2）；▲形成有害物质，抑制微生物生长；消除有害影响的措施采用特殊的加热灭菌法过滤除菌法加入螯合剂煮沸消毒法将水加热至100℃，煮沸15min—30min，可杀死所有营养细胞和部分芽孢，达到消毒物的目的。巴斯德消毒法（Pasteurization）：用较低的温度来杀死其中的病源微生物，这样既保持食品的营养风味，又进行了消毒该法一般是将待消毒的液体食品置于62℃处理30min，然后迅速冷却。即可达到消毒目的。低温长时法(Lowtemperaturelongtime,LTLT)；62.9℃30min处理牛奶高温瞬时法（Hightemperatureshorttime,HTST):71.6℃15s处理牛奶超高温巴斯德灭菌法(Ultrapasteurization):让液体食品停留在140℃左右3-4s，急剧冷却至75℃，经匀质化后冷却至20℃。间歇灭菌法：

将待灭菌物品在80-100℃蒸煮15-60min，冷却后搁置室温（28-37℃）下过夜，并重复以上过程三遍以上。其蒸煮过程可杀死微生物的营养体，但不能杀死芽胞，室温过夜促使残留的芽孢萌发成营养体，再经蒸煮过程可杀死新的营养体；循环三次以上可保证彻底灭菌的目的。适用于不耐高温的物品灭菌，如不适于高压灭菌的特殊培养基、药品的灭菌。缺点是麻烦、费时。低温——低温是通过降低酶反应速度使微生物生长受到抑制。冷藏法：5℃，微生物斜面菌种放置冷藏箱中可保存数周至数月而不衰竭死亡；食品保鲜冷冻法：食品工业中采用-10℃左右的冷冻温度较长时间地保藏食品；冷冻法也可用作菌种保藏，但所需温度更低，如-80℃低温冰箱、或-78℃干冰、或-80℃液氮中冷冻保存。2、低温抑菌（二）辐射作用(radiationSterilization)辐射灭菌是利用电磁辐射产生的电磁波杀死大多数物质上的微生物的一种有效力法。电磁波:微波:通过热产生杀死微生物的作用；紫外线(UV):使DNA分子中相邻的嘧啶形成嘧啶二聚体，抑制DNA复制与转录等功能，杀死微生物；X射线和y射线:使其他物质氧化或产生自由基(OH·、H·)破坏和改变生物大分子的结构，以抑制或杀死微生物。3．过滤作用不耐热的液体培养基的灭菌采用滤孔比细菌还小的筛子或滤膜作成各种过滤器，当空气或液体流经筛子或滤膜时，微生物不能通过滤孔而被阻留在一侧，从而达到灭菌的目的。但不能除去病毒。实验室中常用的滤器：滤膜过滤器、蔡氏过滤器、玻璃过滤器、磁土过滤器等。过滤介质：醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜；以及石棉板、烧结陶瓷、烧结玻璃等。滤器孔径：常用0.22μm

、0.45μm

。应用：对于含酶、血清、维生素和氨基酸等热敏物质除菌。细胞内溶质浓度与胞外溶液的溶质浓度相等时，为等渗溶液,溶液的溶质浓度高于胞内溶质浓度为高渗溶液,溶液的溶质浓度低于胞内溶质浓度为低渗溶液.在等渗溶液中,微生物的活动保持正常,细胞外形不变在高渗溶液中,细胞易失水,脱水后发生质壁分离,生长受抑制或死亡.(盐渍和糖渍保藏食品)在低渗溶液中,细胞吸水膨胀,甚至导致细胞破裂死亡.4.渗透压渗透压和干燥都涉及到水分含量和水活度，它们对微生物的生长都有很大的影响。干燥对微生物的影响干燥抑制微生物生长或造成其死亡的原因：干燥能引起微生物细胞内蛋白质的变性和盐类等物质浓度提高，从而抑制生长或造成微生物死亡5.干燥三、控制微生物的化学物质

1．抗微生物剂

抗微生物剂(antimicrobialagcnt)是一类能够杀死微生物或抑制微生物生长的化学物质根据它们抗微生物的特性可分为：

抑菌剂

杀菌剂

溶菌剂

用机理是这类物质结合到核糖体上抑制蛋白质合成，导致生长停止，由于它们同核糖体结合不紧，它们在浓度降低时又会游离出来，核糖体合成蛋白质的能力恢复，使生长恢复它们是紧紧地结合到细胞的作用靶上，即使在浓度降低时也不能游离出来，因此生长不能恢复能抑制细胞壁合成或损伤细胞质膜抗微生物剂通常又将它们分为消毒剂：可杀死微生物，通常用于非生物材料的灭菌或消毒。防腐剂：能杀死微生物或抑制其生长，但对人及动物的体表组织无毒性或毒性低，可作为外用抗微生物药物。HgCl2、CuSO4、碘液、氯气、乙烯氧化物、甲醛剂、臭氧有机汞、0.1%-1％硝酸银、碘液、70%乙醇、3％过氧化氢类型名称及使用方法作用原理应用范围醇类70%—75%乙醇脱水、蛋白质变性皮肤、器皿醛类0.5%—10%甲醛2%戊二醛（pH=8）蛋白质变性房间、物品消毒（不适合食品厂）酚类3%—5%石炭酸2%来苏儿3%—5%来苏儿破坏细胞膜、蛋白质变性地面、器具皮肤地面、器具氧化剂0.1%高锰酸钾3%过氧化氢0.2%—0.5%过氧乙酸氧化蛋白质活性基团，酶失活皮肤、水果、蔬菜皮肤、物品表面水果、蔬菜、塑料等常用的消毒防腐剂及其应用

常用的消毒防腐剂及其应用类型名称及使用方法作用原理应用范围重金属盐类0.05%—0.1%升汞2%红汞0.1%—1%硝酸银0.1%—0.5%硫酸铜蛋白质变性、酶失活变性、沉淀蛋白蛋白质变性、酶失活非金属器皿皮肤、粘膜、伤口皮肤、新生儿眼睛防治植物病害表面活性剂0.05%—0.1%新洁尔灭0.05%—0.1%杜灭芬蛋白变性、破坏细胞膜皮肤、粘膜、器械皮肤、金属、棉织品、塑料常用的消毒防腐剂及其应用类型名称及使用方法作用原理应用范围卤素及其化合物0.2—0.5mg/L氯气10%—20%漂白粉0.5%—1%漂白粉2.5%碘酒破坏细胞膜、蛋白质饮水、游泳池水地面水、空气等皮肤染料2%—4%龙胆紫与蛋白质的羧基结合皮肤、伤口酸类

0.1%苯甲酸

0.1%山梨酸食品防腐食品防腐各种抗微生物化学制剂杀菌能力的比较标准：石炭酸系数：指在一定时间内被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度和达到同效的石炭酸的最高稀释度的比率。一般规定处理时间为10分钟，而供试菌定为Salmonellatyphi（伤寒沙门氏菌）。在临床上最早使用的消毒剂----石炭酸概念：化学治疗剂是指那些能够特异性地作用于某些微生物并具有选择毒性的化学药剂，它们与非特异的化学药剂相比对人体几乎没有什么毒性或毒性很小，可用作治疗微生物引起的疾病。既适用于涂抹肌体表面，也始于通过口服或注射吸收到体内。种类：

抗代谢药物——人工合成的

抗生素——微生物所产生的化学治疗剂2．抗代谢物

(Antimetabolite)有些化合物在结构上与生物体所必需的代谢物很相似，以至可以和特定的酶结合，从而阻碍了酶的功能，干扰了代谢的正常进行，这些物