与氮素同化相关酶及测定方法

与氮素同化相关酶及测定方法

自然界中N素循环一、植物体内氮的含量与分布

含量：占植物干重的0.3～5％。

植物种类：豆科植物>非豆科植物

品种：高产品种>低产品种

器官：种子>叶>根>茎秆二、氮的生理功能氮是蛋白质的重要成分（蛋白质含氮16～18％）2.氮是核酸和核蛋白的成分（核酸中的氮约占植株全氮的7％）3.氮是酶的成分4.氮是叶绿素（叶绿素a:C55H72O5N4Mg)的成分（叶绿体含蛋白质45～60％）5.氮是多种维生素的成分:如维生素B1(C12H17ON3S)、B2(C17H18O6N4)、B6(C6H11O3N)

6.氮是一些植物激素的成分（如IAA、CTK）7.氮也是生物碱的组分（如烟碱、茶碱、可可碱、咖啡碱、胆碱－－卵磷脂(磷脂酰胆碱）氮素通常被称为生命元素三、植物对氮的吸收(adsorption)与同化

(assimilation)吸收的形态无机态：NO3-－N、NH4+－N （主要）有机态：NH2－N、氨基酸、 核酸等 （少量）

植物从外界环境获得N主要是通过3条途径,通过NO3-还原把无机氮转化为生命体可用的有机氮,通过固氮菌对N2的固定,直接吸收土壤中的铵或有机氮。

植物的氮源主要是铵盐和硝酸盐，占土壤含氮的1%-2%。（一）植物对硝态氮的吸收与同化1.吸收：旱地作物吸收NO3-－N为主，主动吸收

2.同化(1)NO3-－N的还原作用(nitratereduction)过程：NO3-NO2-NH3

NR：硝酸还原酶(nitratereductase)

NiR：亚硝酸还原酶(nitritereductase)

NR，MoNiR，Fe、Mn

根、叶细胞质根、叶绿体

氨的同化植物吸收铵盐以后，或当植物所吸收的硝酸盐被还原成氨后，氨必须立即被同化成氨基酸，否则就会毒害植物。因为氨可能抑制呼吸过程中的电子传递系统。氨的同化方式为：进入谷氨酸合成酶循环。作用酶类：GOGAT:谷氨酸合成酶；存在于叶绿体。GS:谷氨酰胺合成酶；存在于叶绿体和细胞质中。GDH:谷氨酸脱氢酶；存在于线粒体中。过程（1）GDH（谷氨酸脱氢酶）途径酮戊二酸氨谷氨酸各种新的氨基酸酮酸酰胺氨谷氨酸脱氢酶转氨基作用（2）GS-GOGAT途径（谷氨酰胺合成酶－谷氨酸合成酶）是高等植物同化氨的主要途径谷氨酰胺

合成酶COOH│CHNH2│CH2│CH2│CONH2COOH│CHNH2│CH2│CH2│COOH谷氨酸合成酶2H+，2e—COOH│C=O│CH2│CH2│COOHCOOH│CHNH2│CH2│CH2│COOH谷氨酸脱氢酶NH4+吸收NO3—还原N2固定光呼吸NH3NH3NADH谷氨酰胺谷氨酸谷氨酸图1

氨的同化途径的模式ATPNADH铁氧还蛋白

转氨基作用含氮化合物反应式：NH3＋谷氨酸＋ATP谷氨酰胺＋ADP＋Pi谷氨酰胺＋α-酮戊二酸＋2e－＋2H＋

2谷氨酸谷氨酸＋17酮酸17种氨基酸

蛋白质

谷氨酰胺合成酶谷氨酸合成酶转氨酶合成

转氨基作用（transamination）

（1）定义：是指一种α-氨基酸和α-酮酸在转氨酶的作用下生成相应的α-酮酸和新的氨基酸的过程。（2）生物体内两种重要的转氨基作用谷丙转氨基作用谷草转氨基作用谷丙转氨酶（GPT）磷酸吡哆醛++①谷丙转氨基作用②谷草转氨基作用+谷草转氨酶（GOT）磷酸吡哆醛+3.酰胺(amide)的形成及意义形成：NH3＋意义：①贮存氨基； ②解除氨毒； ③参与代谢。

谷氨酸(Glu) 酰胺合成酶 谷氨酰胺(Gln)

天门冬氨酸(Asp)ATP天门冬酰胺(Asn)

铵态氮配方②非脲酶途径：直接同化尿素氨甲酰磷酸瓜氨酸精氨酸（二）植物对有机氮的吸收与同化1.尿素urea（酰胺态氮amidenitrogen）

(1)吸收：根、叶均能直接吸收(2)同化：①脲酶途径：尿素NH3氨基酸

脲酶水解尿素的毒害：当介质中尿素浓度过高时，植物会出现受害症状2.氨基态氮(aminonitrogen)

可直接吸收，效果因种类而异第一类效果>硫酸铵：如甘氨酸、天门冬酰胺等第二类，尿素<AA效果<硫酸铵：如天门冬氨酸等第三类，效果<尿素：如脯氨酸、缬氨酸等第四类，有抑制作用：如蛋氨酸植物转氨酶(GOT和GPT)活度比色测定方法及其应及GOGAT酶活性的测定主要试剂(1)0.05mol/LTris-HCL缓冲液(pH7.2):0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷(24.2g三羟甲基氨基甲烷用蒸馏水溶解并定容至200ml)50ml和0.2mol/LHCl44.2ml,用蒸馏水稀释至200ml。(2)0.1mol/L磷酸盐缓冲液:称取磷酸氢二钠(AR)11.928g,磷酸二氢钾(AR)2.176g,加少量蒸馏水溶解并定容至1000ml。(3)2,4-二硝基苯肼溶液:称取2,4-二硝基苯肼19.8mg,用10mol/LHCL10ml溶解后,加蒸馏水至100ml,保存于棕色瓶中备用,此液可保存3个月。(4)0.4mol/L氢氧化钠溶液:16g氢氧化钠(AR)加蒸馏水溶解并定容至1000ml。(5)1mol/L氢氧化钠溶液:40g氢氧化钠(AR)加蒸馏水溶解并定容至1000ml。(6)丙酮酸标准液(2μmol/ml):精确称取纯丙酮酸钠22.0mg于100ml容量瓶中,加0.1mol/L磷酸盐缓冲液至刻度。此液应新鲜配制。(7)GOT底物液(DL-门冬氨酸200mmol/L,α-酮戊二酸2mmol/L):称取α-酮戊二酸29.2mg和DL-门冬氨酸2.66g置于一小烧杯中,加入1mol/L氢氧化钠20.5ml使溶解,并校正pH至7.4,然后将溶液移入100ml容量瓶内,用0.1mol/L磷酸盐缓冲液定容至刻度。放置冰箱内保存。(8)GPT底物液:(DL-丙氨酸200mmol/L,α-酮戊二酸2mmol/L):称取α-酮戊二酸29.2mg和DL-丙氨酸1.79g置于一小烧杯中,加入0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)约80ml煮沸溶解后,待冷,用1mol/L氢氧化钠调pH至7.4(约加0.5ml),再加0.1mol/L磷酸盐缓冲液至100ml混匀,加氯仿数滴防腐,贮于冰箱内。1·酶粗制剂的提取将新鲜植物材料剪碎,取鲜重0.2g左右放入研钵,加0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.2)2.0ml,在冰浴中研磨,得到的匀浆用高速离心机20000×g离心20min,上清液供测酶活度用。2·谷草转氨酶(GOT)活度测定取10ml试管2支,一支作测定管,分别加酶粗制剂0.1ml和GOT底物液0.5ml,另一支作对照管,仅加酶粗制剂0.1ml。将二管同时置37℃水浴,60min后取出,各管加2,4二硝基苯肼液0.5ml终止反应,对照管再加GOT底物液0.5ml。将二管再置37℃水浴中20min,取出后各管加0.4mol/LNaOH5.0ml,混匀,10min后用分光光度计比色,波长500nm,蒸馏水调零点,读取吸光度。将测定管吸光度减去对照管吸光度,得吸光度差值,查工作曲线即可查得丙酮酸体积(ml)。若查得的丙酮酸体积超过0.2ml时应将酶粗制液稀释后再进行测定,测定结果乘以稀释倍数即得丙酮酸体积V(ml)。工作曲线绘制:取10ml试管5支,各管加0.1mol/L磷酸盐缓冲液0.1ml,分别加GOT底物液0.5、0.45、0.40、0.35、0.30ml,丙酮酸标准液0(对照管)、0.05、0.10、0.15、0.20ml。置37℃水浴5min,各管加2,4-二硝基苯肼溶液0.5ml,混匀,再置37℃水浴中20min,取出后各管加0.4mol/L氢氧化钠溶液5ml,混匀,10min后同上比色,读取各管吸光度。各管吸光度分别减去对照管吸光度,以各管丙酮酸体积为横座标,以相应的吸光度差值为纵座标绘制工作曲线。3·谷丙转氨酶(GPT)活度测定取10ml试管2支,一支作测定管,分别加酶粗制剂0.1ml和GPT底物液0.5ml,另一支作对照管,仅加酶粗制剂0.1ml。将二管同时置37℃水浴,30min后取出,各管加2,4-二硝基苯肼液0.5ml终止反应,对照管再加GPT底物液0.5ml。将二管再置37℃水浴中20min,取出后各管加0.4mol/LNaOH5.0ml,混匀,10min后用分光光度计比色,波长500nm,蒸馏水调零点,读取吸光度。将测定管吸光度减去对照管吸光度,得吸光度差值,查工作曲线即可查得丙酮酸体积(ml),若查得的丙酮酸体积超过0.2ml时应将酶粗制液稀释后再进行测定,测定结果乘以稀释倍数即得丙酮酸体积V(ml)。工作曲线绘制:取10ml试管6支,各管加0.1mol/L磷酸盐缓冲液0.1ml,分别加GPT底物液0.5、0.45、0.40、0.35、0.30、0.25ml,丙酮酸标准液0(对照管)、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25ml。置37℃水浴中5min,各管加2,4-二硝基苯肼溶液0.5ml,混匀,再置37℃水浴中20min,取出后各管加0.4mol/L氢氧化钠溶液5ml,混匀,10min后同上比色,读取各管吸光度。各管吸光度分别减去对照管吸光度,以各管丙酮酸体积为横座标,以相应的吸光度差值为纵座标绘制工作曲线。(四)结果计算转氨酶活度以每克植物鲜样在30min内反应生成的丙酮酸微摩尔(μmol)表示。GOT活度,μmol/g·30min=(C×V×20)/(m×2)GPT活度,μmol/g·30min=(C×V×20)/(m×2)式中,C—丙酮酸标准溶液的浓度(μmol/ml);V—由工作曲线查得的丙酮酸体积(ml);20—稀释倍数;2—反应时间换算系数,GOT实际反应时间为1h,按习惯本法酶活性以30min计算〔4〕,故应除以2;m—植物鲜重(g)粗酶液制备取1g水稻根/叶，置于冰浴的研钵中，加入少量石英砂和3ml提取缓冲液（100mmol/LTris-HCl(pH7.6)含1.0mmol/LEDTA，1.0mmol/LMgCl2·6H2O，10mmol/Lβ-琉基乙醇）于4℃研磨成匀浆。混合均匀后于高速冷冻离心机4℃、20,000g离心20min（13，000g30min），收集上清，即为粗酶提取液，置于-80℃冰箱中冻存，待测。粗酶液用于Gs、NADH-GOGATH的活力测定。提取液配置：（Tris，121.14；EDTA，372.24；MgCl2·6H2O，203.3；β-琉基乙醇原液14.4mol/L）1L提取液的配置：12.114gTris+0.3722gEDTA+0.2033gMgCl2·6H2O用900ml水溶解，+0.7mlβ-琉基乙醇原液后，用1mmol/LHCl调pH值至7.6，然后定容至1L。500ml提取液的配置：6.057gTris+0.1861gEDTA+0.1016gMgCl2·6H2O用450ml水溶解，+0.35mlβ-琉基乙醇原液后，用1mmol/LHCl（原液稀释12000倍,83ul定容至100ml）调pH值至7.6，然后定容至500ml。GS测定：（1）合成酶活性反应液配制：(50mmol/L咪唑-HCl(pH7.2)含40mmol/LMgSO4,90mmol/LL-谷氨酸,6mmol/L羟胺)(咪唑，68.077；无水氯化镁，120；L-谷氨酸，147.13；羟胺，33.03)500ml反应液：1.702g咪唑+2.4gMgSO4+6.621gL-谷氨酸+0.099g羟胺用450ml蒸馏水溶解，再用1mMHCl调节pH至7.2，定容至500mL250ml反应液：0.851g咪唑+1.2gMgSO4+3.311gL-谷氨酸+0.050g羟胺用200ml蒸馏水溶解，再用1mMHCl调节pH至7.2，定容至250mL（2）10mmol/LATP-Na(3个水，606.24):0.0666g定容至11ml（3）酸性FeC13终止液（2%(WV/)TCA+3.5%(WV/)FeC13·6H2O+2%HCl）配制:2gTCA+3.5gFeC13·6H2O+5.333mlHCl原液（分析纯浓盐酸一般为37.5%，摩尔浓度近似为12mol/L），用蒸馏水溶解后，定容至100ml.（4）测定（1个处理，3个管（1个对照，两个重复））反应总体积2ml：1.9ml(1ml活性反应液+0.8ml蒸馏水+0.1ml粗酶液)混合液在37℃预热2-3min后加入0.1ml10mmol/LATP启动反应。混合均匀后，37℃室温保温15min后，立刻加入1mlFeC13终止液终止反应，然后3000g离心5min，上清液于540nm处测定吸光值。空白对照：按顺序加入1ml活性反应液+0.8ml蒸馏水+0.1ml10mmol/LATP+1mlFeC13终止液+0.1ml粗酶液，然后3000g离心5min，上清液于540nm处测定吸光值。（5）一个GS活性单位定义为每分钟于37℃产生1umol的r—谷氨酰异羟肟酸一glutamylhydroxmate)所需的酶量。（6）标准曲线的制作：以r—谷氨酰异羟肟酸做标准曲线取1ml反应液，37℃预保温，5min后分别加入0，0.5，1.0，1.5，2.0，3，4，5，6，7mM的谷氨酰基异羟肟酸1ml，混合均匀后，37℃室温保温15min后，立刻加入1mlFeC13终止液终止反应，摇匀后在540nm波长下比色，以蒸馏水作对照，做标准曲线，根据标准曲线得出谷氨酰基异羟肟酸计算公式：=7.9*OD540-0.162

NADH-GOGAT活性的测定NADH-GOGAT活性测定按singh(1986)报道的方法进行。测活贮备液:A:20mmol/L谷氨酰胺(146.15)0.2923g定容至100mlB:100mmol/La-酮戊二酸(146.11)1.4611g定容至100mlC:10mmol/LKCl(74.551)0.0745g定容至100mlD:25mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7.6)1.514g定容至500mlE:3mmol/LNADH(新鲜配制)(709.4)0.017g定容至8ml空白对照为0.4mL(A)+0.05mL(B)+0.lmL(C)+2.45mL(D)。测活管:0.05mLB+0.lmLC+1.95mLD(测定前可以按照10:20:390比例混匀后，取混合液2.1ml)30℃水浴中预热几分钟后,按顺序加入0.2mLE和0.3mL酶液,再加入0.4mLA,混匀,立即启动反应，紫外分光光度计在340nm处测光吸收,倒回试管,30℃水浴,三分钟后再测一次光吸收,计算差值。NADH-GOGAT酶活性单位定义为:每分钟反应混合液于30℃减少1umolNADH为一个酶活性单位。NADH-GDH活性的测定:NADH-GDH(还原型GDH)和NAD+-GDH(氧化型GDH)的活性测定,参照Loulkakais等(1990)的方法。NADH-GDH测活贮备液:6.9898gTris+1.6876gα-酮戊二酸+6.179gNH4Cl定容至500ml(pH怎么调？还是分开配)？115.4mmol/LTris-HCI(pH8.0)，23.1mmol/Lα-酮戊二酸，231mmol/LNH4Cl(53.5)NADH贮备液(709.4):6mmol/L0.017g定容至4mlCaCl2:贮备液(110.98):30mmol/L0.3329g定容至100ml先在准备好的试管中加入2.6mL测活贮备液，按顺序加入0.lmLCaC12，0.lmLNADH，0.lmL蒸馏水。再加入0.lmL酶液启动反应，并于340mn处测定吸光值，三分钟后再测定一次，计算差值。以水代替NADH和酶液作为空白对照管。NADH-GDH