优秀研究生答辩幻灯片 ppt

欢迎各位专家莅临指导单肺通气诱发肺损伤时兔肺组织线粒体转录因子A表达的变化及乌司他丁的干预效应研究生：XXXXXX导师：教授二级学院：XXXX人民医院

材料与方法研究目的结论讨论结果研究背景目录Contents我将从以下几个方面向大家介绍我的研究论文。首先是研究背景单击研究背景ResearchBackground单肺通气(one-lungventilation，OLV)的应用已有50多年的历史，是指患者经支气管导管仅利用单侧肺(非术侧肺)进行通气的方法。主要目的是提供良好的手术视野，避免患侧肺对健侧肺的污染，减少呼吸运动对手术操作的干扰，随着外科技术的发展，OLV已广泛应用于心胸外科及脊柱手术的麻醉。GothardJ.Lunginjuryafterthoracicsurgeryandone-lungventilation.CurrOpinAnaesthesioli,2006,19(1):5-1050

6070

80

90

100开胸手术中1h2h3h长时间单肺通气萎陷侧肺快速复张吸入高浓度氧急性肺损伤FiO2：

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手术操作研究背景ResearchBackground细胞内氧自由基增多可介导IL-1、TNF-α等前炎性因子增多，使中性粒细胞募集诱发炎症反应。中性粒细胞可释放髓过氧化物酶（MPO），MPO主要功能是利用过氧化氢和氯离子产生次氯酸盐（HOCl），并形成具有氧化能力的自由基单肺通气诱发肺损伤的机制研究背景ResearchBackground线粒体是参与细胞能量代谢的重要细胞器，线粒体功能障碍可导致组织缺氧。细胞内氧自由基增多，首先攻击线粒体基因。线粒体基因（mtDNA）氧自由基RuchkoM,GorodnyaO,LeDouxSP,etal.MitochondrialDNAdamagetriggersmitochondrialdysfunctionandapoptosisinoxidant-challengedlungendothelialcells.AmJPhysiolLungCellMolPhysiol,2005,288(3):L530-535线粒体是参与细胞能量代谢的重要细胞器，线粒体功能障碍可导致组织缺氧。细胞内氧自由基增多发生氧化应激反应，主要损伤线粒体基因。线粒体研究背景ResearchBackground线粒体呼吸链功能蛋白线粒体转录因子A

线粒体转录因子A（mtTFA）是mtDNA转录翻译线粒体结构蛋白和功能蛋白的重要启动子。其高表达可使mtDNA数量增加，对维持mtDNA稳定具有重要意义。mtDNA是转录翻译线粒体呼吸链功能蛋白的细胞核外重要遗传物质翻译线粒体基因（mtDNA）FukuohA,KangD.MethodsforassessingbindingofmitochondrialtranscriptionfactorA(TFAM)toDNA.MethodsMolBiol,2009,1760(2):87-101线粒体DNA是转录翻译线粒体呼吸链功能蛋白的细胞核外重要遗传物质，单击线粒体转录因子A是这一复杂过程的重要启动子之一，其高表达可使mtDNA数量增加，对维持线粒体DNA稳定有重要意义研究背景ResearchBackground细胞核线粒体乌司他丁含有143个氨基酸的糖蛋白，主要通过肾脏代谢,给药后12h可通过尿和粪便排泄。乌司他丁是分离纯化成年男性尿液得到的蛋白水解酶抑制剂。减轻内毒素引起肺损伤InoueK,TakanoH,YanagisawaR,etal.Antioxidativeroleofurinarytrypsininhibitorinacutelunginjuryinducedbylipopolysaccharide.IntJMolMed,2005,16(6):1029-1033减轻油酸引起肺损伤JinLY,XuJM,HeZB,etal.[Effectofulinastainontheexpressionofhemeoxygenase-1inoleicacid-inducedacutelunginjuryinrats].ZhongNanDaXueXueBaoYiXueBan,2007,32(4):675-678减轻手术操作引起肺损伤JinLY,XuJM,HeZB,etal.[Effectofulinastainontheexpressionofhemeoxygenase-1inoleicacid-inducedacutelunginjuryinrats].ZhongNanDaXueXueBaoYiXueBan,2007,32(4):675-678减轻机械通气引起肺损伤DzierzbickiP,Kaniak-GolikA,MalcE,etal.Thegenerationofoxidativestress-inducedrearrangementsinSaccharomycescerevisiaemtDNAisdependentontheNuc1(EndoG/ExoG)nucleaseandisenhancedbyinactivationoftheMRXcomplex.MutatRes,2012,740(1-2):21-33乌司他丁UlinastainInoueK,TakanoH,YanagisawaR,etal.Antioxidativeroleofurinarytrypsininhibitorinacutelunginjuryinducedbylipopolysaccharide.IntJMolMed,2005,16(6):1029-1033乌司他丁是临床上常用的蛋白水解酶抑制剂，对其结构功能研究较为深入，临床研究发现，乌司他丁具有减轻内毒素、油酸、手术操作、机械通气等引起的肺损伤。研究背景ResearchBackground单肺通气诱发急性肺损伤时肺组织产生

炎症反应和氧化应激导致线粒体基因受损线粒体功能障碍

是否与mtTFA有关尚不清楚乌司他丁具有减轻肺损伤清除氧自由基和减轻炎症反应抑制水解酶活性保护线粒体其机制是否与mtTFA有关尚不清楚？？研究背景ResearchBackground材料与方法研究目的结论讨论结果研究背景研究目的ResearchObjective

本研究通过建立兔单肺通气致肺损伤模型，拟探讨单肺通气诱发肺损伤时肺组织线粒体转录因子A表达的变化及乌司他丁的干预效应，为临床防治单肺通气诱发急性肺损伤提供理论依据。材料与方法研究目的结论讨论结果研究背景双肺通气组Twolungsvenlilation单肺通气组Onelungsvenlilation乌

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组UlinastaininterventionU组O组D组动物选择及分组根据文献，单肺通气模型动物种类：材料与方法Materialsandmethods实验分组本实验选用国内外研究单肺通气最常用的动物：新西兰大白兔根据文献，单肺通气动物模型有以下几种，本实验选用国内外研究单肺通气最常用的动物：新西兰大白兔。单击选择健康雄性大白兔24只，单击采用随机数字表法，随机分为3组：双肺通气组、单肺通气组、乌司他丁干预组。单击健康雄性大白兔24只，体重2.0～2.5kg，常规分笼喂养。由河北医科大学实验动物中心提供D组双肺通气3h，O组和U组左肺通气2h后再双肺通气1h。通气参数双肺通气时VT为24ml、单肺通气VT为12ml、FiO2100%，通气频率40次/min，I:E为1:2。通气结束后开胸，取双侧肺尖部组织。模型建立与标本采集D组及O组在通气即刻静脉注射等量生理盐水。U组通气即刻静脉注射乌司他丁50kU/kg单肺通气组Onelungsvenlilation乌

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组Ulinastainintervention双肺通气组Doublelungsvenlilation这是我们按照文献方法自制的双枪气管插管单击D组、O组通气即刻静注生理盐水，U组静注乌司他丁50KU/kg单击D组双肺通·气3h，O组和U组左肺通气2h后再双肺通气1h。通气参数设为双肺通气时潮气量为24ml、单肺通气为12ml、吸入氧浓度100%，通气频率40次每分，吸呼比为1:2单击材料与方法Materialsandmethods自制双腔气管插管参照文献：游志坚,姚尚龙,李进.三种兔单肺通气模型的比较.中国实验动物学报,2007,15(4):245-248液氮检测方法取肺尖部组织装入冻存管，液氮冻存24h后转−80℃冰箱保存于通气开始即刻（T0）、通气1h（T1）、通气2h（T2）、通气结束即刻（T3）采集动脉血取肺尖部组织置入4℃

4%多聚甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋、切片这是我们的观察指标及检测方法。多聚甲醛多聚甲醛化学比色法检测肺组织SOD活性和MDA含量Westernblot法检测兔肺组织mtTFA表达免疫组化法检测兔肺组织mtTFA表达血气分析动脉血氧分压，计算氧合指数HE染色观察肺组织病理学损伤评分观察指标及材料与方法Materialsandmethods材料与方法研究目的结论讨论结果研究背景结果Result各组兔肺组织病理学改变以及肺损伤评分各组兔一般情况比较各时间点氧合指数比较

各组兔肺组织超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的含量各组兔肺组织中mtTFA的含量结果分五部分，首先是各组兔一般情况比较单击各组兔一般情况比较D组、O组及U组兔体重分别为（2.2±0.6）kg、（2.4±0.8）kg及（2.4±0.5）kg，各组兔体重差异无统计学意义（P＞0.05）。

D组、O组及U组兔通气过程心率为（211±10）次/min、（209±8）次/min及（208±8）次/min，平均动脉压为（44±4）mmHg、（40±6）mmHg及（39±4）mmHg，各组兔心率、平均动脉压差异无统计学意义（P＞0.05）。各组兔体重及通气过程心率平均动脉压差异无统计学意义。结果ResultComparewithD各时间点氧合指数比较ComparewithT0ComparewithT0结果Result各组兔肺组织SOD活性和MDA含量的比较结果ResultComparewithDComparewithDComparewithleftlungComparewithleftlungComparewithOComparewithOO组右侧U组右侧各组肺组织病理学结果D组右侧O组左侧D组左侧U组左侧400350300250200150100500D组O组U组右肺左肺D组双侧肺组织肺泡结构基本完整，肺泡腔内无明显渗出、出血、间质增厚、炎性细胞浸润；O组左侧肺组织肺泡结构破坏，肺泡腔内少量渗出物，少量出血，间质轻度增厚，炎性细胞浸润较少。O组右侧肺组织大部分肺泡结构消失，肺泡腔内有渗出较多，出血多，间质明显增厚，炎性细胞较多；U组左右侧肺组织比O组左右侧肺组织损伤程度轻。将上述图片进行根据病理损伤评分，得出数据显示：长时间单肺通气肺组织mtTFA表达下调。2、乌司他丁具有减轻单肺通气损伤，与上调肺组织mtTFA表达有关1、长时间单肺通气肺组织病理学损伤评分升高。2、与单肺通气组比较，乌司他丁组肺组织病理学损伤评分下降。结果Resultcomparewithlunginjuryscoresingroups结果表明：与D组相比，O组肺组织mtTFA表达降低；

与O组肺组织相比较，U组肺组织mtTFA表达升高O组右侧U组右侧D组右侧O组左侧D组左侧U组左侧400350300250200150100500D组O组U组左肺右肺免疫组化法测定各组肺组织mtTFA表达结果ResultWesternblot结果以密度扫描分析：采用美国Bandscan5.0软件对Westernblot结果进行定量分析，灰度值以累积光密度值（IOD）表示，结果通过以下公式计算：mtTFA蛋白累积光密度值GAPDH的累积光密度值

mtTFA蛋白半定量=DLDROLORULURWesternblot法检测各组肺组织mtTFA表达mtTFA表达GAPDH

结果表明：与D组相比，O组肺组织mtTFA表达降低；

与O组左侧肺组织相比，O组右侧肺组织mtTFA表达降低；

与O组肺组织相比较，U组肺组织mtTFA表达升高。

与免疫组化法测定mtTFA结果一致。D组O组U组结果Result左肺右肺

TheexpressionleveloflungtissuemtTFAwasmeasuredbywesternblotindifferentgroups.材料与方法研究目的结论讨论结果研究背景研究表明，氧合指数<300mmHg(1mmHg=0.133kPa)时即可认为发生肺损伤。O组、U组通气结束时氧合指数<300mmHg，提示氧饱和下降，出现轻微的低氧血症。光镜下单肺通气后肺组织大部分肺泡结构消失，肺泡腔内有渗出，出血多，间质增厚，炎性细胞大量聚集。综合肺组织病理学结果及血气分析结果，O组、U组通气结束时氧合指数<300mmHg，氧饱和下降，出现轻微的低氧血症，提示兔单肺通气诱发肺损伤模型制备成功。乌司他丁减轻肺损伤机制

肺损伤时肺组织脂质过氧化反应及与mtTFA关系单肺通气致肺损伤的机制单肺通气诱发肺损伤模型的制备讨论

Discussion动脉血氧合指数比较：O组、U组通气结束时氧合指数<300mmHg，提示氧饱和下降，出现轻微的低氧血症。肺组织病理学损伤评分：光镜下单肺通气后肺组织大部分肺泡结构消失，肺泡腔内渗出，出血多，间质增厚明显，炎性细胞聚集。研究表明，氧合指数<300mmHg(1mmHg=0.133kPa)时即可认为发生肺损伤。

本研究结果表明：O组、U组通气结束时氧合指数<300mmHg，提示通气结束时氧饱和下降，出现轻微的低氧血症。根据文献，对肺泡结构、肺间质水肿增厚、肺泡内渗出、出血、炎性细胞浸润程度进行评分，>3分为重度损伤本研究结果表明，光镜下单肺通气后肺组织大部分肺泡结构消失，肺泡腔内渗出，出血多，间质增厚明显，炎性细胞聚集。单肺通气诱发肺损伤模型的建立讨论

Discussion研究表明，氧合指数<300mmHg(1mmHg=0.133kPa)时即可认为发生肺损伤。本研究结果表明，O组、U组通气结束时氧合指数<300mmHg，提示氧饱和下降，出现轻微的低氧血症。

根据文献，对肺泡结构、肺间质水肿增厚、肺泡内渗出、出血、炎性细胞浸润程度进行评分，>3分为重度损伤光镜下单肺通气后肺组织大部分肺泡结构消失，肺泡腔内有渗出，出血多，间质增厚，炎性细胞大量聚集。综合肺组织病理学结果及血气分析结果，O组、U组通气结束时氧合指数<300mmHg，氧饱和下降，出现轻微的低氧血症，提示兔单肺通气诱发肺损伤模型制备成功。单肺通气诱发肺损伤模型制备成功单肺通气诱发肺损伤机制

单肺通气诱发非通气侧肺损伤比通气侧严重本研究结果表明，与O组左侧比较，O组右侧肺组织肺损伤评分升高、SOD活性降低、MDA含量升高、mtTFA表达下调。提示非通气侧肺组织损伤严重，其机制可能为非通气侧肺组织长时间萎陷，肺泡Ⅱ型细胞膜上Na+-K+-ATP酶活性较肺通气侧明显下降，阻碍肺泡间质内的肺水重吸收，因此肺泡内渗出液增多。单肺通气转为双肺通气时，产生的界面切力和肺水滞留，是引起非通气侧肺组织受到牵张而损伤严重的重要原因。肺快速复张时，可造成膨胀和不张肺组织的交界处产生:界面切力肺水滞留讨论

Discussion单肺通气诱发肺损伤机制本研究结果表明，与D组比较，O组肺组织SOD活性下降，MDA含量增加，提示单肺通气致肺损伤时兔肺组织发生氧化应激反应。其机制可能为：炎性起始的中性粒细胞募集，释放MPOMPO介导释放TNF-αIL-1中性粒细胞募集髓过氧化物酶讨论

DiscussionMPOMPOMPOMPOMPOMPO细胞超微结构模拟示意图线粒体转录因子A（mtTFA）线粒体环状DNA（mtDNA）O2-线粒体超微结构模拟示意图细胞核内DNA组蛋白减轻炎症反应清除氧自由基防止细胞钙超载抑制水解酶的活性研究表明乌司他丁乌司他丁是分离纯化成年男性尿液得到的蛋白水解酶抑制剂。乌司他丁覃建明.乌司他丁的药理作用及临床应用进展[J].中国医药导报,2008,(11):19-20谭朝华,徐军美,杨昭云,杨东林,吕志平.乌司他丁对急性肺损伤兔炎性细胞因子及氧自由基的影响.中国医师杂志,2004,(10):1360-1362.讨论

Discussion乌司他丁calciumoverload防止钙超载Inflammatoryreaction减轻炎症反应hydrolaseactivi