细菌漆酶LacA在大肠杆菌中的异源表达

细菌漆酶LacA在大肠杆菌中的异源表达组员（按学号排序如下）：刘艳红、王瑞、姚伟静、张明珠、康兴、程飞、孙元元、刘燕红、程旭、査倩、潘伟民、傅声祥汇报人：程飞实验简介实验原理实验目的实验材料实验过程一、实验简介漆酶（Laccase）是一种含酮的多酚氧化酶，能够催化多种酚类和非酚类化合物发生氧化，同时伴随由分子氧还原成水。漆酶一般由500-600个氨基酸组成，不同来源的漆酶氨基酸序列的相似程度较低，但是其催化位点序列相当保守。对漆酶的晶体结构进行研究，发现其分子具有3个铜离子结合位点，共结合四个铜离子。野生漆酶的产量低，重组表达是提高漆酶产量的一种常用方法。本实施主要通过由保守区设计简并引物扩增部分漆酶LacA片段，以及反向PCR扩增已知序列临近的未知序列，并且通过序列拼接获得完整的LacA基因序列，并转化大肠杆菌，进行异源高效表达。二、实验目的获得细菌LacA基因。LacA在大肠杆菌中异源表达。三、实验原理DNA重组。简并引物。酶。TA克隆：将3´端具有单个“A”突出末端的PCR产物克隆到3´端具有单个“T”突出末端的载体的克隆法。反向PCR:反向PCR是一种新型的基因扩增方法，它能扩增一段已知序列旁侧的DNA。载体选择。蓝白筛选：

质粒载体含有大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（lacz）的启动子（受IPTG诱导）及其编码α肽链（β-半乳糖苷酶的氨基末端短片段）的DNA序列（特称为lacz基因）。受体大肠杆菌细胞的β-半乳糖苷酶发生了突变，失去的氨基末端。当lacz基因编码的α肽链同失去了正常氨基末端的β-半乳糖苷酶突变体互补时，便会产生出有活性的β-半乳糖苷酶分子，在IPTG诱导下，会启动表达，分解X-gal产生蓝色背景。当MCS中插入外源基因后，会阻断α肽链合成，不能形成互补，不能产生功能活性的β-半乳糖苷酶，也就不会产生蓝色背景。所以含有重组质粒载体的克隆是白色的。四、实验材料1.实验仪器（1）超微量分光光度计。（2）制冰机。（3）高压灭菌器。（4）PCR仪。（5）电子天平。（6）磁力搅拌器。（7）电泳仪。（8）冷冻离心机。（9）高速离心机。（10）凝胶成像系统。（11）冷冻研磨仪。（12）超净工作台。（13）烘箱。（14）液氮罐。（15）pH剂。2.实验试剂(1)载体：质粒pMD18-T，质粒pET-28a（+）。(2)产漆酶LacA细菌。(实验室自备)。(3)限制性内切酶：BamHI，SalⅠ。(4)T4DNA连接酶；TaqDNA聚合酶。(5)0.1mol/LCaCl2溶液。(6)LB琼脂固体平板（含Kana）。(7)LB液体培养基。(8)20mg/mLX-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）。(9)200mg/mLIPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)。(10)琼脂糖。(11)无菌双蒸水。(12)JM109感受态细胞。(13)卡那霉素50mg/L。(14)液氮。(15)合成引物。(16)PARAFILM。(17)Tubes。(18)溴化乙锭。(19)Agarose。(20)Sodiumchloride。(21)TRYPTONE。(22)YEASTEXTRACT。(23)TE缓冲液T10E1。(24)甘油。(25)CutSmartBuffer。(26)ABTS。(27)上样缓冲液。(28)T4DNALigaseBuffer。(29)Trans2KplusDNAMarker。(30)2XPowerTaqPCRMaster。(31)酚/氯仿/异戊醇。(32)高纯质粒小量制备试剂盒100次。(33)普通DNA产物纯化试剂盒（离心柱形）。(34)乙醇。(35)裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH8.0）。(36)Tris-饱和酚、氯仿。五、实验步骤（一）、依据蛋白质保守区设计引物（二）、PCR扩增保守区之间的基因序列（三）、反向PCR获得全长基因（四）、构建重组表达载体（五）、异源表达以及蛋白活性检测1.引物设计原则2.上游引物与下游引物1.碱裂解法提取细菌基因组DNA2.PCR扩增保守区之间的序列3.胶回收以及纯化DNA4.目的片段与载体连接以及目的片段测序测序。1.反向PCR引物设计2.细菌基因组酶切3.自身环化连接4.反向PCR5.测序以及序列拼接获全长基因1.细菌基因组DNA提取以及引物设计2.表达载体选择3.获得LacA基因并与载体连接4.阳性重组子筛选1.异源表达2.LacA蛋白分离纯化3.LacA活性检测（一）依据蛋白质保守区设计简并引物1.依据蛋白质保守区设计简并引物2.上游引物以及下游引物1.依据蛋白质保守区设计简并引物引物设计原则：尽量降低简并度；起始密码子ATG，终止密码子TAA,TAG,TGA不使用。密码子偏好性；大肠杆菌中的稀有密码子；2.上游引物PFHWHGIRL(取两个碱基即可）CATTGGCATGGTATTCGTCTCACCACGGCATCCGCCTGGAATACGACTGGGATGCGGCTAGATTAGGTTCAYTGGCAYGGNATHMGNYTM代表AorCY代表CorTH代表AorCorTD代表AorGorTN代表GorAorTorC红色代表不可用

FR:CAYTGGCAYGGNATHMGNYT简并度：576/4用次黄嘌呤代替N（因为次黄嘌呤能很好的和4种碱基配对）降低简并度。53下游引物PR35R代表AorG

FR:TGRTCNGTNACRTGRCARTG简并度：256（二）PCR扩增保守区之间的基因序列2.PCR获取保守区之间的序列。1.提取细菌基因组DNA，利用SDS法。3.胶回收以及胶回收纯化试剂盒纯化DNA4.目的片段与载体连接以及目的片段测序测序。1.SDS法提取细菌基因组DNA1.5ml菌液4℃12000rpm离心30sec加入400µl裂解液，用移液枪枪头反复抽吸辅助裂解，37℃水浴30min加入Xµl的5MNaCl溶液，颠倒试管，充分混匀后，13000rpm离心15min,取上清。纯化DNA,等体积苯酚/氯仿/异戊醇沉淀DNA,1/10体积3mol/lNaAc，2,5倍体积预冷无水乙醇70%乙醇沉淀50ulTE含20ug/mlRase-20℃备用2.PCR获取保守区之间的序列细菌基因组200ng10XTaqBuffer（Mg2+）5uldNTPs200μmol/LFPRPTaqDNA聚合酶0.5-1.5mMddH20TOTAL50ul94℃94℃55℃72℃依据聚合酶聚合速度cycles4min40s35s100s30sTaqDNA聚合酶能产生3’A的尾巴，因此PCR产物可以用于TA克隆首次使用PCR之前，要仔细阅读说明书。除特别指出外，加入反应成分的每一步都需在冰上操作。加入TaqDNA聚合酶后，都要混匀体系，并且用离心机轻甩一次。3.胶回收以及纯化DNA配置含1%agarase的凝胶将PCR产物点样至胶孔里，添加Loadingbuffer，并点上markerPCR试剂盒回收目的片段测出DNA浓度。注意A260/A280（不小于1.8）以及A260/A230的值（不小于2.0）DNA样品添加上样缓冲液，其中含有甘油或者蔗糖，帮助DNA沉入胶的底部，其中还有溴酚蓝或者二甲苯青，指示样品迁移情况。5’端磷酸化纯化：等量的苯酚/氯仿/异戊醇沉淀：1/10体积3mol/lNaAc，2,5倍体积预冷无水乙醇。TE溶解。回收DNA10Xbutter10mmol/LATPT4多核苷酸激酶20UPCR产物回收:a.熔化：3倍体积bufferDE-A，75℃，温浴。b.结合：混合液加入DNA制备管12000rpm，1min。3.洗涤：加500μlbufferW1.加700μLbufferW2.重复一次。3.洗脱：75℃无菌水洗脱，12000rpm，1min，收集，测浓度。T克隆载体1.载体用EcoRV产生突出的T2.经Taq聚合酶PCR产物3’段有突出的A。3.经连接酶连接就能将基因片段和载体连接。4.目的片段与载体连接以及测序连接产物转化E.coliJM109感受态细胞设立对照回收产物连接到pMD18-T载体上提取质粒（试剂盒：高纯质量少量制备试剂盒（离心柱型）测浓度测序载体：外源基因（摩尔比）=1:2~1:10载体/外源片段=载体含量（ng）X插入片段的长度

插入片段所需量（ng）X载体长度连接产物转化JM109感受态细胞。a:加10ul连接产物到含有50ulcompetentcell的1.5mlEP管中，冰上放置30min。b:将EP管放入42度水浴锅中热激45sc:重新放入冰中2min。d:加入1mLLB培养基，放到37度复苏1h。e:将复苏后的菌体离心收集，涂含有Kana抗生素的LB固体板。f:将板放到37度培养箱培养16h后，对长出来的菌落做菌落PCR鉴定阳性克隆。19（三）反向PCR获得全长基因1.反向PCR原理。2.PCR引物设计3.细菌基因组酶切4.自身环化连接5.长距离反向PCR6.测序以及序列拼接全长基因1.长距离反向PCR原理2.反向PCR引物设计（1）根据LacA的部分基因序列，设计两个特异的反向PCR引物。（由于测序结果未知，所以此处无法给出具体的引物序列）（2）IPs（3）IPa

注意：IPs和Ipa3’方向是相互背离的。不同于常规的PCR。3.细菌基因组酶切酶切体系基因组2μgbuffer限制性内切酶20U温度37℃时间4hddH2Ototal100μl（1）选用4种限制性内切酶（X1，X2，X3，X4。对基因组的DNA分别进行单酶切，前提是保证这四种酶在LacA上没有酶切位点。

方法：通过细菌基因组序列以及保守序列周围的序列，根据一般漆酶基因的大小，确定这四种限制性内切酶。（2）酶切产物纯化（PCR产物纯化试剂盒）。（3）测浓度。自身环化连接体系酶切后基因组DNA0.5μg10XT4Buffer100μlT4DNA连接酶300U温度16℃时间16hddH2OTOTAL1000μl4.自身环化连接（1）自身连接产物纯化（TIANquickMidiPurificationKit普通DNA产物纯化收试剂盒同前面内容）。（2）测浓度。5.反向PCR94℃94℃70℃cycles2min40S13min34s（1）配置含1%agarase的凝胶。（2）将PCR产物点样至胶孔里，添加Loadingbuffer，并点上marker，染料使用EB。（3）用刀片切取含有目的片段的琼脂糖凝胶，试剂盒纯化DNA。(4)DNA磷酸化处理。（5）测浓度。连接产物转化E.coliJM109感受态细胞回收产物连接到pMD18-T载体上提取质粒（试剂盒：高纯质量少量制备试剂盒（离心柱型）测浓度测序以及序列拼接。序列拼接采用DNASTAR软件的SeqMan程序。由重叠部分即可拼接出完整的全长基因。6.测序以及序列拼接全长基因获得的全长基因提交GeneBank（四）构建重组表达载体1.细菌基因组DNA的提取以及引物设计。2.表达载体的选择pET-28-a（+）。3.获取LacA基因并与载体连接。1.细菌基因组DNA的提取以及引物设计（1）SDS法提取细菌基因组DNA（2）引物设计原则a、由已知的LacA基因序列设计引物。b、在引物5’端设计酶切位点，以及添加保护碱基。软件使用Primer5。FPa5’CGGGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN3’含有BamHI酶切位点。FRa5’ACGCGTCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN3’含有SalI酶切位点。

2.表达载体的选择pET-28a（+）3.获取LacA基因并与载体连接PCR获得LacA基因序列细菌基因组200ng10XTaqBuffer（Mg2+）5uldNTPsFPaRPaTaqDNA聚合酶ddH20TOTAL50ul（1）PCR获得LacA基因序列（2）双酶切PCR产物，试剂盒纯化，测浓度。（3）双酶切载体，纯化，测浓度。（4）LacA与载体连接。（5）转化JM109。双酶切PCR产物10xcutsmartbuffer2ulBamHI-HF0.5ulSalI-HF0.5ulPCRLacA1ngddH2OTOTAL20ul温度与时间37℃4h双酶切pET-28a10xcutsmartbuffer2ulBamHI-HF0.5ulSalI-HF0.5ulpET-28a1ngddH2OTOTAL20ul温度与时间37℃4hLacA与载体连接10xT4Ligasebuffer2ulT4Ligase0.5ulpET-28a0.5ul酶切后LacA1ngddH2OTOTAL20ul温度与时间16℃过夜4.阳性重组子筛选（1）重组子涂平板筛选重组子的培养基：Kana50ug/mg,x-gal是2%,每个平板取40uL涂布，IPTG是20%每个平板取7uL涂布。

特注：Kana添加是在倒平板温度降到可以用手触摸再添加。X-gal和IPTG在平板凝固之后涂布。

（2）设对照组。阳性对照与阴性对照。

（3）在Kana抗性的平板可以生长，阳性菌落产生的是白色菌落。（4）阳性重组子进行菌落PCR鉴定。（5）液体扩大培养。提取质粒，测序。

涂布添加X-gal，IPTG和Amp的平板（五）异源表达以及蛋白检测挑选的白色菌落，扩大培养，提取质粒，测序。如果测序为LacA则保存菌种（1:5

=甘油：菌种保存于-70℃冰箱。）异源表达：液体培养。大量产生发酵液。1.异源表达2.LacA蛋白的分离纯化（1）实验材料准备-LB培养工程菌并离心收集（2）预处理-清洗菌体并重悬（3）蛋白质粗提-超声破碎离心（4）蛋白质