临床免疫实验2

《医学免疫学》实验二

实验内容一、淋巴细胞转化实验（操作一）MTT法二、酶联免疫吸附试验（操作一）ELISA（双夹心法）法检测乙肝表面抗原（HBsAg）

一、淋巴细胞转化实验

（MTT法操作一） 原理方法结果应用MTT法——

四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法

原理：T淋巴细胞在有丝分裂原刺激下，发生有丝分裂，形成淋巴母细胞。其蛋白质合成与DNA合成及代谢比正常细胞旺盛，活细胞线粒体中某些酶可将MTT还原为蓝黑色甲臜．用ＤＭＳＯ溶解甲臜，在５７０nm处测ＯＤ值，能够反映Ｔ淋巴细胞的增殖转化程度．MTT法活/增殖期的细胞线粒体能量代谢琥珀酸脱氢酶MTTMTT掺入还原甲臢颗粒formazan细胞内/周围溶解测OD值MTT-四甲基偶氮唑盐丝裂原MouseHumanTBTBConA++++-PHA+-++-PWN++++/-LPS-+--SpA---+实验步骤无菌取1/2的脾研磨成单细胞悬液细胞计数(40×)96孔培养加板(三复孔)调细胞浓度1×107/ml5%CO237℃培养44小时加入MTT(5mg/ml)10ul/well5%CO237℃继续培养4小时轻轻吸去上清，加DMSO，溶解甲臜颗粒A570nmELISAplatereader实验组加入不同浓度ConADay1Day3注意事项:由于本实验需要培养3天，才能观察结果。因此，在操作时应注意无菌操作，避免细菌污染，导致实验的失败。实验步骤：(本次课完成)1、制备脾细胞悬液1）取脾：用1000ul加样器取5ml培养液放入平皿中.颈部脱臼处死小鼠，酒精消毒，无菌取脾脏，用毛玻璃片磨碎，放在平皿中，隔着纱布吸出细胞悬液放入离心管中，离心1500r/min,20min。弃去上清,加入3mlIMDM培养液，混匀。2）细胞计数：取0.2ml

放入一试管中,加入1.8ml细胞计数液。取20ml填充细胞计数板,显微镜下计数。计数方法>>。

3）调细胞浓度到5×10６/ml：如配制10mL稀释细胞悬液:从细胞悬液中取(2000/X)mL至试管,加入培养液至10ml即可。细胞计数方法细胞计数方法l查出四个16个大方格的总细胞数(X)l算出每个大方格的细胞数：Y=X÷4l每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4mll制备的细胞悬液的细胞浓度（A/ml)=Y×104×稀释倍数(10)4××实验步骤（本次课完成）2、加板每孔加入100ml的调好的细胞悬液1-3孔(对照)加入10%FCS-IMDM100ml4-6孔加入20mg/ml的ConA100ml7-9孔加入10mg/ml的ConA100ml10-12孔加入5mg/ml的ConA100ml3、细胞培养：5%CO2孵箱内37℃培养48h。4、MTT掺入：在终止培养前4小时（培养44小时）加入MTT(5mg/ml)10ml/孔，继续培养，至48小时终止培养(此步骤由实验小组长完成)。实验步骤：(下次课完成)5、结果测定：弃上清，加入DMSO(100ml/孔)，振荡溶解甲臢颗粒。充分溶解后用酶标仪测定其吸光度值。OD570nm。形态学淋巴母细胞在形态学上的表现主要有体积明显增大，是成熟淋巴细胞的3~4倍；染色质疏松，核仁清晰可见；胞浆丰富并形成空泡。根据细胞的大小，核与胞浆的比例，胞浆的染色性和核结构以及有无核仁等特征，分别计数淋巴母细胞、过渡型母细胞和核丝分裂相细胞以及成熟的小淋巴细胞，以前三者为转化细胞，每份标本计数200个细胞，按下式计算转化率：淋巴细胞转化实验的应用 检查患者细胞免疫功能估计疾病的疗效及预后细胞配型抗原的检查：移植免疫－MLR免疫药理学：具有免疫调节的药物、保健品、中草药及生物制品卫生毒理学的研究二、ELISA（双夹心法）法检测乙肝表面抗原（HBsAg）

【目的】1.掌握酶联免疫吸附试验的原理。2.熟悉ELISA的基本类型和用途。3.掌握用酶联免疫吸附试验双抗夹心法检测乙型肝炎表面抗原的方法。【实验原理】先将已知抗体包被在固相上，洗去未吸附的抗体；加入待检标本，充分作用后，标本中相应的抗原与固相上已知抗体结合，洗去未结合的抗原成分；加入已知的酶标抗体，再洗去未结合的酶标抗体；加底物后，酶分解底物产生呈色反应，根据颜色的深浅判定待检标本中抗原的量。固相载体最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。Enzyme常用的酶辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)。碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,AP)。葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。HRP的底物邻苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)四甲基联苯胺(3,3‘,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB)OPDOPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。OPD本身难溶于水，OPD·2HCL为水溶性。OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用。OPD产物用硫酸终止后，显色由橙黄色转向棕黄色

返回>>ApplicationofELISA目前应用最广泛的免疫学检测技术之一，常用来检测机体的可溶性的抗原或抗体。敏感性高，可检测微量的的抗体体或激素、细胞因子及粘附分子等抗原性物质。成品的试剂盒，已广泛用于某些临床疾病的诊断。返回>>常用的ELISA方法直接法(DirectELISA)间接法(IndirectELISA)夹心法(SandwichELISA)直接法间接法夹心法【材料与试剂】1．材料：酶标板（96孔）、微量加样器、酶标检测仪、湿盒、水浴箱，43℃培养箱2．试剂：1）包被抗体：抗HBs(用包被缓冲液稀释2ug/ml)2）酶标抗体（HRP—抗HBs,用洗涤液稀释1:300）3）HbsAg表面抗原（乙肝疫苗,用样本稀释液稀释1600ng/ml即1.6ug/ml）4）模拟待检样品（HBsAg疫苗,用样本稀释液稀释400ng/ml即0.4ug/ml）5）包被缓冲液pH9.6\0.05mol/L碳酸盐缓冲液。6）洗涤液0.01MpH7.4PBS含0.1%Tween20（不含任何防腐剂）。7）封闭液：0.01mol/L、PH7.4PBS内含1%BSA,。8）样品稀释液含0.25%BSA-洗涤液。9）底物缓冲液（pH5.0）0.2MNa2HPO425.75ml+0.1M柠檬酸24.25ml+30%H2O2100μl。10）底物溶液邻苯二胺(OPD)1mg/ml溶于底物缓冲液中，临用前配制。11）终止液2mol/LH2SO4（22ml浓H2SO4+178mldH2O）。【实验学时】2.5学时，分两次课完成。【实验步骤】第一次操作，用时25分钟1、抗体包被：用包被液将抗HBs稀释至适当浓度（2ug/ml），酶标板中1~10孔每孔加100μl，11~12做空白对照（不加样）,将反应板移至温盒内，4℃放置过夜（可保存一周，下次课后续操作）。第二次操作，下次课完成，用时100分钟2、封闭：弃去包被液，每孔加入200ul封闭液，11~12孔空白对照,置43℃温箱20min。3、洗涤：弃去包被板孔内液体，用洗涤液注满1~10孔，静置1~3min后甩干，洗涤1次，于吸水纸上拍干。4、加样：1-2、4-8每孔加样品稀释液100μl，3、4孔加1.6ug/mlHbsAg表面抗原，100ul/孔，自第4孔混匀后吸出100ul加入第5孔，以此方法对倍稀释至8孔,吸出100ul弃之,9\10孔加入待检样品100ul/孔,轻轻振动混匀置于43℃20min，弃去孔内液体，用洗涤液洗涤3次，每次1~3分钟,拍干。5、加酶标抗体：每孔加HRP—抗HBs100μl（空白孔不加），置于43℃20min