植物组织培养技术86878126

植物组织培养技术1绪论组培是二十世纪发展起来的新技术，近四十年来发展极为迅速，几乎以植物为研究对象的各个分支学科都在广泛进行组织培养。

1902年，德国植物学家Haberlandt

根据细胞学说提出细胞全能性（totipotency）理论。初步成功：1904年Hanning

最先成功培养了萝卜和辣根菜的胚→开始大量实验，技术逐步完善→1960年“兰花工业”巨大利润冲击→促使新一轮研究热潮兴起→奠定新兴独立学科→植物组织培养学。

目前达到的水平：从任何植物器官、组织、细胞甚至没有细胞壁的裸露原生质体中再生小植株。在这一技术基础上各国竞相投资，在快繁、脱毒、育种、次生代谢物生产、种质资源的保存方面取得了巨大的社会、经济、生态效益。第一章植物组培的基本理论

第一节植物组培的概念

一.概念

广义：离体条件下利用人工培养条件在无菌情况下培养、生长、发育再生出完整植株的过程。

狭义：将离体植物器官、组织、细胞和原生质体培养在人工配置的培养基上，给予适当培养条件，使细胞增殖或诱导长成完整的植株。根据外植体来源又分：

（一）按培养对象可分：

1.植株培养：是对完整植株材料的培养，如幼苗及较大植株。

2.器官培养：离体器官的培养，根据作物和需要不同，包括分离茎尖、茎段、根尖、叶片、叶原基、子叶、花瓣、雄蕊、雌蕊、胚珠、胚、子房、果实等外植体培养。

3.组织或愈伤组织培养：为狭义组织培养，对植物体各部分组织进行培养，如茎尖分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮组织、胚乳组织和薄壁组织等；或对由植物器官培养产生的愈伤组织进行培养，二者均通过再分化诱导形成植株。

4.细胞培养：对由愈伤组织等液体振荡培养得到的，能保持较好分散性的离体单细胞或花粉单细胞，或很小的细胞团的培养。

5.原生质体培养：用酶及物理方法除去细胞壁的原生质体的培养。

（二）根据培养条件可分：液体培养、固体培养、半固体培养、光培养、暗培养二.常用名词的解释

1.愈伤组织(callus)：在培养基上由外植体形成的一团无序生长的薄壁细胞。

器官发生→植株胚状体发生→人工种子、转基因材料外植体→愈伤组织悬浮细胞培养→次生代谢物培养原生质体培养→细胞融合

2.外植体(explant)：由植物体取下接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。

特点：多细胞，组成细胞类型不同，形成愈伤组织有异质性，不同组分细胞具有不同的形成完整植株的能力，即再分化能力。几十年来人们广泛尝试不同材料作外植体，如Haberlandt用叶肉细胞、髓细胞、腺毛、雄蕊毛、气孔保卫细胞。由于对细胞性质和条件摸索不够均未成功。基本上用薄壁组织，成熟组织如机械组织、输导组织、分泌组织不易成功（如山西农科院用果柄。复习组织类型）

适宜的外植体材料：薄壁细胞、形成层。

不适宜的外植体材料：成熟组织不宜，如瓜皮、果柄。

第二节植物组织培养的理论基础一.植物细胞的全能性（totipotent)

概念:植物细胞具有该植物体全部遗传的可能性，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。植物细胞只要有完整膜系统和有生命力的核，即使已高度成熟分化，还保持回复到分生状态的能力。

原理：生物体每个细胞都含有该物种全套遗传物质，有发育成为完整个体所必需的全部基因，理论上讲，每个活细胞都具有全能性。差异：1.受精卵全能性最高。受精卵－胚－种子－幼苗－植株，即说明全能性；2.受精卵分化后，体细胞的全能性比生殖细胞低。

体细胞从合子的有丝分裂产生，也具全能性，有遗传信息的传递、转录和翻译能力。完整植株上某一部分体细胞只表现一定形态，承受一定功能，是受具体器官或组织所在环境束缚，其遗传潜质并没消失，一但脱离束缚，条件适宜即表现全能性。

潜在全能性原因：基因表达的选择性。处于离体状态的植物活细胞，在一定营养物质、激素和外界条件作用下，即可表现出全能性。人工条件下实现这一过程，就是植物组织培养。

二.植物细胞全能性表达不少植物繁殖就是通过根茎叶等器官再分化而成，如扦插繁殖，原因：受伤组织--创伤激素--促使周围组织生长--愈伤组织--内源激素促使储存营养--新器官。

植物组培技术扩大此项功能，使植物的范围、再生部位均扩大。自然条件下营养器官和细胞再生困难，是内源激素调整缓慢或不全面，外界条件不易控制。组培在人工控制条件下通过调整培养基，特别是对激素成分调整，有可能顺利实现。

分化：胚性细胞几乎无差异。随种子萌发，细胞分裂分化为根茎叶等器官--逐渐失去分裂能力，形态结构及功能发生永久性适应变化的过程，即--。

原因：由基因决定。基因在时空上差次表达的结果。

结果：细胞分裂能力丧失，通常不会恢复直至死亡。脱分化：已分化的、停止分裂的细胞，从植物体部分抑制性影响下解脱出来，恢复分裂活性。把成熟细胞放到培养基上，即发生恢复分裂能力的现象。溶酶体分解失去功能细胞质--酶活使蛋白质合成代谢改变--基因表达改变--返老还童。

再分化：脱分化的组织或细胞（愈伤组织）在一定培养条件下，可有转变为各种不同细胞类型的能力。

已分化的细胞表达全能性必须经脱分化、再分化，即细胞培养目的：设计培养基、创造培养条件即组培目的。原则是如何使细胞完成脱分化和再分化，主要工作为设计、筛选培养基；探索建立合适的培养条件，摸索植物激素的主要作用。三.外植体离体分化过程的类型

1.无菌短枝型也称节培法或微扦插。将待繁殖材料剪成带一叶的单芽茎段转入成苗培养基，一定时间后可成苗，再剪成带一叶的单芽茎段，继代又可成苗。

特点：一次成苗，遗传稳定，过程简单，适用范围大，移栽易成活。试管繁殖常用，也是其他方法最后阶段常用方法，但初期繁殖速度慢。

2.丛生芽增殖型茎尖或初代培养的芽在适宜培养基上诱导，不断发生腋芽而成丛生芽，再转入生根培养基诱导生根成苗，扩大繁殖。

特点：从芽到芽，遗传稳定，繁殖速度快，是茎尖培养和脱毒苗初期必由之路。但过程复杂，品种差异大。

3.愈伤组织再分化，有两种方式：

A.不定芽：指愈伤组织培养物，通过形成不定芽再生成植株，这是细胞和组织培养中常见的器官发生方式。愈伤组织的器官发生顺序：

（1）愈伤组织有根或芽的分别形成，即无根的芽或无芽的根；（2）先形成芽，芽伸长后在茎基长出根，形成小植株。多数植物属此；（3）先产生根，再从根基部分化出芽，形成小植株。较难诱导芽形成，尤其单子叶；（4）先在愈伤组织邻近部位分别形成芽和根，然后结合形成小植株。

B．胚状体：由培养细胞诱导分化出的胚芽、胚根、胚轴的胚状结构而植株

4.原球茎型第三节植物组培技术的特点

一.培养条件可以人为控制组织培养采用的植物材料，完全在人为提供的培养基质和小气候环境条件下生长，摆脱大自然四季、昼夜变化及灾害性气候影响。条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定、周年培养生产。

二.生长周期短，繁殖率高

组培是人为控制培养条件，根据不同植物不同部位不同要求提供不同培养条件，因此生长快。另外植株比较小，往往20-30d为一周期。所以，虽然有设备及能源消耗，由于材料能按几何级数繁殖，总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。

三.管理方便，利于工厂化生产和自动化控制

组培是在一定场所和环境下，人为提供温度、光照、湿度、营养、激素等条件，既利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。是未来农业工厂化育苗的方向。与盆栽、田间栽培相比，省去中耕除草、浇水施肥、防治病虫害等系列繁杂劳动，可节省人力、物力及田间种植所需要土地。四.植物组织培养的材料经济

取材少，培养效果好，对品种推广及复壮均有意义。非洲紫罗兰一枚叶片，三个月可得5000株苗。第二章植物组培的发展和应用

第一节发展简史

一.植物组织培养的探索阶段

1838-1839年，德国科学家Schleide

和Schwann发表了细胞学说，奠定组织培养理论基础。

1902年，德国植物学家Haberlandt

根据细胞学说，提出单个细胞的植物细胞全能性（totipotency）理论。

1904年，Hanning

最先成功地培养了萝卜和辣根菜的胚。

1922年，Knudson采用胚培养法获得大量兰花幼苗。

1934年，White用番茄根尖建立起第一个活跃生长的无性繁殖系，从而使非胚器官的培养首先获得成功。

二.植物组织培养的技术建立阶段

1933年李继侗培养银杏离体胚（3mm的胚），添加胚乳、种子、果实提取物。

1934年美国White由番茄根建立第一个无性繁殖系，28年继代1600代。并研究光、温度、通气、pH值、培养基组成的影响，于1937年建立第一个综合培养基，定名为White培养基。

1934年Gautherer提出B族维生素和生长素的作用，于1939年培养胡萝卜根形成层获成功。同年White由烟草种间杂种的瘤组织，Nobecourt由胡萝卜建立连续生长的培养物。因此，Gautherer，White和Nobecourt一起誉为组培学科奠基人。现在所用培养方法和培养基，基本由这三位科学家建立。

1943年White发表《植物组织培养手册》，使组培成为新兴学科。

40年代Skoog和崔徵明确腺嘌呤与生长素比例是控制芽根形成的主要条件。比例高-芽，低-根；相等则不分化。

1956Miller等人发现激动素可代替腺嘌呤，效果可增3万倍。上述模式变为激动素与生长素比例。这一发现有力推动组培发展。

1952年Morel和Martin首次获得无病毒植株。

1958年，英国科学家Steward等用胡萝卜根愈伤组织细胞悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整植株，使细胞全能性理论得到证实，且为组培技术程序奠定基础。三.植物组培的迅速发展阶段

1960年，Morel提出离体无性繁殖兰花，繁殖系数极高。被兰花生产者所采用，迅速建立起兰花工业。

1960年，Cocking等人用真菌纤维素酶分离植物原生质体获成功。

1971年，Takebe等用烟草原生质体获再生植株，不仅理论上证明无壁的原生质体同样具有全能性，且在实践上为外源基因导入提供理想受体。80年代中期以来，对禾谷类原生质体培养相继告捷，中国学者做出重要贡献。

1962年，Murashinge和Skoog

在烟草中筛选出仍被广泛使用的MS培养基。

1964-1