核磁共振波谱分析-9

二维核磁共振谱1971年Jeener首先提出2D-NMR思想：具有两个时间变量的NMR；1976年Ernst小组成功实现了2D-NMR实验后，确定了二维核磁共振的理论基础；20世纪80年代：2D-NMR加速发展；用途：解析复杂有机分子最有力的工具；溶液中分子的三维空间结构的测定；分子动态过程的研究；多维NMR技术：研究生物大分子（蛋白质、核酸等）最有效的方法。概述NMR一维谱的信号是一个频率的函数，共振峰分布在一个频率轴(或磁场)上，可记为S(ω)。而二维谱信号是两个独立频率变量的函数，记为S(ω1,ω2)，共振信号分布在两个频率轴组成的平面上。也就是说2DNMR将化学位移、偶合常数等NMR参数在二维平面上展开，于是在一般一维谱中重迭在一个坐标轴上的信号，被分散到由两个独立的频率轴构成的平面上，使得图谱解析和寻找核之间的相互作用更为容易。不同的二维NMR方法得到的图谱不同，两个坐标轴所代表的参数也不同。概述减少了谱线的拥挤和重叠，提高了核之间相互关系的新信息，因而增加了结构信息，有利于复杂谱图的解析。1D2D2D谱比1D谱谱峰分辨能力更强可在两维巧妙地设计某些物理量以考察它们的相关性或连接关系2signalsoverlapped2crosspeaksresolved位移相关谱二维实验的脉冲序列预备期：使自旋体系恢复Boltzmann分布，而处于初始热平衡状态。理论上应取D1≥5T1（T1为纵向弛豫时间），但为节省时间，实验中一般取D1=(2～3)T1。发展期：在预备期末，施加一个或多个90脉冲，使系统建立共振非平衡状态。演化时间t1是以某固定增量t1为单位，逐步延迟t1。每增加一个t1，其对应的核磁信号的相位和幅值不同。因此，由t1逐步延迟增量t1可得到二维实验中的另一维信号，即F1域的时间函数。混合期：由一组固定长度的脉冲和延迟组成。在混合期自旋核间通过相干转移，使t1期间存在的信息直接影响检测期信号的相位和幅值。根据二维实验所提供的信息不同，也可以不设混合期。检测期：在检测期期间采集的FID信号是F2域的时间函数，所对应的轴通常是一维核磁共振谱中的频率轴，即表示化学位移的轴。但检测期期间采集的FID信号都是发展期的函数，核进动的磁化矢量具有不同的化学位移和自旋偶合常数，其FID信号是这些因素的相位调制的结果。因此，通过控制时间长度可使某期间仅表现化学位移的相位调制，而某期间又仅表现自旋耦合的相位调制，通过施加不同的调制就产生了各种不同的二维核磁共振谱。相干转移谱和极化转移谱基于耦合的相关转移谱：核自旋间的J耦合（通过原子核间化学键电子的间接作用而发生的耦合，又称间接耦合），与横向磁化强度相联系基于动力学过程的极化转移谱：D耦合（不需要经过介质的空间相互作用，又称直接耦合或偶极偶极耦合），与纵向磁化强度相联系二维谱的表现方式

堆积图

Stackedtraceplot

等高线图(平面等值线图)

Contourplot

截面图

Section

投影图

Projection堆积图堆积图含有全部的强度信息，同时由于它的直观性，很易引人注目。但是，堆积图有某些缺点：由于透视图的扭曲难于进行解释；如果大信号之后存在小信号，则由于大信号峰的掩盖，致使小信号峰测不出来。必要的时候需要从不同角度进行透视。画堆积图很费时间，可能要一小时或更长。等高线图等高线图为把堆积图用平行于F1和F2域的平面进行平切后所得。等高线图中最中心的圆圈表示峰的位置，圆圈的数目表示峰的强度。强度信息部分损失。保存强度信息量的多少，取决于平切面的最低线和平切的次数。如果最低线太低，将出线许多噪音信号，干扰真实信号；如太高，一些小的真正信号易被忽略。等高线图很容易鉴定，而且不像堆积图那些隐藏信号，另外不存在透视图的扭曲，测试时间也较短，几分钟便能完成画图。堆积图等高线图CHCl3的H-HCOSY谱投影图投影图是1D谱形式，相当于宽带质子去偶氢谱，可准确确定各谱峰的化学位移值。投影图截面图从2D图中取出某一个谱峰（F1或F2）所对应相关峰的1D断面图，对检测一些弱小的相关峰很有用。截面图二维谱峰的命名交叉峰或相关峰(crosspeak)：出现在ω1≠ω2(即非对角线上)处。从峰的位置关系可以判断哪些峰之间有偶合关系，从而得到哪些核之间有偶合关系，交叉峰是二维谱中最有用的部分。对角峰(diagonalpeak)或自相关峰(Autopeak)：位于对角线(ω1＝ω2)上的峰，称为对角峰。对角峰在F1或F2轴的投影得到常规的偶合谱或去偶谱。交叉峰或相关峰对角峰或自相关峰交叉峰或相关峰对角峰或自相关峰二维谱的分类J分解谱

JResolvedSpectroscopy,d-J谱同核(homonuclear),异核(heteronuclear)化学位移相关谱

ChemicalShiftCorrelationSpectroscopy,d-d谱同核偶合,异核偶合,NOE和化学交换多量子谱

MultipleQuantumSpectroscopyJ分解谱一维谱中谱峰往往严重重叠，造成谱线裂分不能清楚分辨，耦合常数不易读出。二维J分解谱是将不同的NMR信号分解在两个不同的轴上，使重叠在一起的一维谱的化学位移δ和偶合常数J分解在平面两个坐标上，便于解析。在二维J分解谱中，只要化学位移略有差别，峰组的重叠就有可能避免，从而解决一维谱谱峰重叠的问题。1.同核J分解谱同核J分解谱AX体系1.同核J分解谱同核J分解谱所用脉冲序列18090t1/2t1/2谱信息:(弱偶合体系)Δν/J≥10时为弱偶合，一级图谱。

w2:全去偶谱→化学位移dH，转动前化学位移与耦合常数同时出现。w1:谱线多重性→偶合常数JHH，峰组的峰数一目了然。若为强偶合体系，其同核J谱的表现形式将比较复杂。1.同核J分解谱AX体系J谱AX21JAX21JAX2体系J谱同核J分解谱AX3体系J谱A2X3体系J谱δ(f2)J(f1)0HzδJ0Hz2DJ谱在F2维的投影为完全去偶氢谱。2.异核J分解谱谱信息:w2:全去偶谱

→化学位移dCw1:谱线裂分

→偶合常数JCH（直接相连的氢原子耦合裂分产生）

异核二维J分解谱中被测定的核的化学位移为一维，该种核与另一种核之间偶合的多重峰裂分为另一维。2DC-HJ分解谱

由于使用的脉冲序列不同，可以得到几种图谱。应用最多的为门控去偶异核13C-1HJ分解2DNMR。此时F2轴为13C的化学位移δC，F1轴为JCH偶合的多重峰。

出峰情况是CH为二重峰，CH2为三重峰，CH3为四重峰，季碳单峰或不出峰。由于DEPT等测定碳原子级数的方法能代替异核J谱，且检测速度快，操作方便，因此异核J谱较少应用。化学位移相关谱同核化学位移相关谱1)通过化学键：COSY,TOCSY,2D-INADEQUATE2）通过空间：NOESY,ROESY异核化学位移相关谱1)强调大的偶合常数：HMQC(1H-13C–COSY)2)强调小的偶合常数，压制大的偶合常数：COLOC(HMBC)(远程1H-13C–COSY)

含有两个频率轴和一个强度轴提供相互偶合的观察核之间的相关关系信息对复杂分子（如生物分子）的结构确定以及分子与分子之间相互作用的研究非常有用。可了解生物分子在溶液状态时的空间结构（X-单晶衍射无法做到）化学位移相关谱1.1H-1HCOSY最常用的位移相关谱，简化多重峰，直观地给出耦合关系。

相当于做一系列连续选择性去耦实验去求得耦合关系，用以确定质子之间的连接顺序，可提供全部1H-1H之间的关联。因此1H-1HCOSY是归属谱线，推导结构及确定结构的有力工具。两组对角峰和交叉峰可以组成一个正方形，并且由此来推测这两组核A(δA,δA)和X(δX,δX)有偶合关系。同核化学位移相关谱

(HomonuclearCorrelationofchemicalshift)解谱方法：以任一交叉峰为出发点，可以确定相应的2组峰组的耦合关系而不必考虑氢谱中的裂分峰形。交叉峰是沿对角线对称分布的，因而只分析对角线一侧的交叉峰即可。一般反应3J耦合关系，远程耦合较弱，不产生交叉峰。当3J较小时（如两面角接近90o）也可能无交叉峰。1H-1HCOSYF1和F2皆为化学位移。两组对角峰为对角线与两组交叉峰组成正方形，说明这两组质子有偶合。2,3-二溴丙酸的碳上3个质子为AMX系统。

2,3-二溴丙酸的AMX体系1H-1HCOSYC=C-O-CH2-CH2-CH2-CH3HHH1234567

12345674756231COSY-90º的基本脉冲序列包括两个基本脉冲在此脉冲作用下，根据发展期t1的不同，自旋体系的各个不同的跃迁之间产生磁化传递，通过同核偶合建立同种核共振频率间连接图。此图的二个轴都是1H的δ，在ω1＝ω2的对角线上可以找出一维1H谱相对应谱峰信号。通过交叉峰分别作垂线及水平线与对角线相交，即可以找到相应偶合的氢核。因此从一张同核位移相关谱可找出所有偶合体系，即等于一整套双照射实验的谱图。

COSY-90º

COSYof2－丁烯酸乙酯COSY-45º基本脉冲：90º-t1-45º-ACQ.

在COSY-90的基础上，将第二脉冲改变成45º，许多的天然产物的直接连接跃迁谱峰在对角线附近，导致谱线相互重叠，不易解析。采用COSY-45º由于大大限制了多重峰内间接跃迁，重点反映多重峰间的直接跃迁，减少了平行跃迁间的磁化转移强度，即消除了对角线附近的交叉峰，使对角线附近清晰，有利于发现强耦合体系之间的相关峰。从COSY-45可判别耦合常数的符号。化合物A的COSY45º谱，对角线峰显著简化，谱峰清晰。由交叉峰所显示的倾斜度识别出只有1、2位存在同碳氢耦合，其余为邻碳氢耦合。COSY-90COSY-45谱中任意一个交叉峰含两个紧靠的矩形（它们共同形成一个交叉峰），通过稍下的矩形中心往稍上的矩形中心连线，可得到一倾斜的箭头。箭头指向左上为正，箭头指向右上为负。2，3-二溴丙酸通常通过偶数键偶合的偶合常数J为负值，通过奇数键偶合的偶合常数J为正值。X

M

A2.总相关谱

（TOtalCorrelationSpectroscopY,TOCSY）是一种旋转坐标系实验（自旋锁定实验），自旋锁定是把COSY序列中的第二脉冲以及NOESY序列中最后两个脉冲（包括混合时间），用一个长射频脉冲取代，把自旋沿着旋转坐标系的一个锁定，在这种情况下不存在化学位移差，通过发生标量偶合的磁化转移，导致了全部相关。TOCSY也有称之为HOHAHA。可以提供自旋系统中偶合关联信息。TOCSY把COSY的作用延伸，从任一氢的峰组可以找到与该氢核在同一耦合体系的所有氢核的相关峰。TOCSY的外型与COSY相似，但交叉峰的数目大大增加。TOCSY质子a,b,candd构成自旋体系既一个偶合网络系统,CH3CH2构成另外一个网络系统，这是两个独立的自旋体系

，COSY谱中，a与b相关而在TOCSY谱中，它不仅显示与质子b相关，而且也与两个（CH2）candd相关。

3.天然丰度的双量子13C谱

INADEQUATE(13C-13CCOSY)2D-INADEQUATE(IncredibleNaturalAboundanceDoublE

QUAntumTransferExperiment）直接测定13C-13C之间的连接关系，在质子去偶的13C谱中，除了13C信号外，还有比它弱200倍的13C-13C偶合卫星峰，13C-13C偶合含有丰富的分子结构和构型的信息。由于碳是组成分子骨架，它更能直接反映化学键的特征与取代情况。横轴为13C化学位移，纵轴为双量子相干频率，相互偶合的两个碳原子作为一对双峰排列在同一水平线上。但是由于13C天然丰度仅仅为1.1%，出现13C-13C偶合的几率为0.01％，13C-13C偶合引起的卫线通常离13C强峰只有20Hz左右，其强度又仅仅是13C强峰的1/200，这种弱峰往往出现在强13C峰的腋部，加上旋转边带，质子去偶不完全，微量杂质的影响等因素，使1JC-C测试非常困难。利用双量子跃迁的相位特性可以压住强线，突出卫线求出JC-C,并根据Jc-c确定其相邻的碳。13C-13CCOSY它只有一个双量子跃迁，其频率正比于两个偶合的13C核的化学位移之和的平均值。所以如果两个碳具有相同的双量子跃迁频率，即可以判断，它们是相邻。在INADEQUATE谱图中F1与F2分别代表双量子跃迁频率和13C的卫线，依次代表双量子和单量子跃迁频率。谱图中一个轴是13C的化学位移，一个为双量子跃迁频率，其频率正比于两个偶合的13C核的化学位移之和的平均值。因此谱图中F1=2F2的斜线两侧对称分布着两个相连的13C原子信号，表示碳偶合对的单量子平均频率与双量子频率间的关系，水平连线表明一对偶合碳具有相同的双量子跃迁频率，可以判断它们是直接相连的碳。依此类推可以找出化合物中所有13C原子连接顺序。2DINADEQUATE谱所用脉冲序列180y90x90x13C:90φΔΔ[ψ]t12DINADEQUATE的2种形式F2域为化学位移，F1域为双量子跃迁频率，相互耦合的2个碳原子作为一对双峰排列在平行于F2域的同一水平线上。一对耦合的碳（相当于AX体系）具有相同的双量子跃迁频率，用水平连线示出，如：C1-C2,C2-C3,C3-C4。由于双量子频率为偶合的一对13C－13C的单量子频率之和，连线的中心落在F1=2F2的准对角线上。2143567OHHO6-75-64-51-22-33-41423567谱信息：F2

是碳谱，单量子频率F1是双量子频率，为偶

合的一对13C－13C的单量子频率之和一对13C－13C处于水平线上，左右对称地处于准对角线（F1=2F2)两侧。F2域和F1域均为13C化学位移，类似于H-HCOSY谱，相互耦合的2个碳原子作为一对双峰出现在对角线两侧对称的位置上。2DINADEQUATE的2种形式4.NOESY(NuclearOverhauserEffectSpectroscopY)NOESY反映了有机化合物结构中核与核之间空间距离的关系，而与二者间相距多少根化学键无关。因此对确定有机化合物结构、构型和构象以及生物大分子（如蛋白质分子在溶液中的二级结构等）有着重要意义。NOESYNOESY的谱图与1H-1HCOSY非常相似，它的F2维和F1维上的投影均是氢谱，也有对角峰和交叉峰，图谱解析的方法也和COSY相同，唯一不同的是图中的交叉峰并非表示两个氢核之间有耦合关系，而是表示两个氢核之间的空间位置接近。由于NOESY实验是由COSY实验发展而来为的，因此在图谱中往往出现COSY峰，即J偶合交叉峰，故在解析时需对照它的1H-1HCOSY谱将J偶合交叉峰扣除。在相敏NOESY谱图中交叉峰有正峰和负峰，分别表示正的NOE和负的NOE。NOESYNOESY谱所用的脉冲序列909090t1tm“inversion”NOESYNOESYHbHaHcCHbHaHcδ(f2)δ(f1)COSYOFPBFNOESYofPBFCOSY当遇到中等大小的分子时（分子量约为1000-3000），由于此时NOE的