时间分辨荧光蛋白

时间分辨荧光蛋白Time-ResolvedProteinFluorescence荧光蛋白的时间分辨测量time-resolvedmeasurementsofprotein

fluorescence越来越普遍原因：时域（TD）和频域（FD）仪器越来越可靠研究的挑战缺少简单的脉冲光源从蛋白质随时间变化的数据解释该现象1、蛋白质的荧光的单光子激发需要波长在280至305纳米的范围内。2、蛋白质荧光激发脉冲激光二极管尚未公布。脉冲LED用于蛋白质的荧光激发刚刚宣布，但脉冲宽度超过1纳秒。3、最近的研究所用的脉冲将Ti的三倍频输出：蓝宝石激光或同步加速器辐射。缺乏的认识色氨酸本身的强度衰减多个色氨酸残基存在于一个单一的蛋白质，并显示在复杂的衰变动力学当中色氨酸本身在在中性pH溶液中显示一个多指数或者非指数衰减1.INTENSITYDECAYSOFTRYPTOPHAN:

THEROTAMERMODEL色氨酸旋转异构体模型的强度衰变用时间分辨在解释蛋白质的衰变强度时的困难在于对色氨酸本身强度衰减缺乏了解在中性水溶液中的色氨酸的强度衰减是一种已知的双指数衰减，时间近3.1和0.5ns色氨酸双指数衰变占主导地位是由于旋转异构体的存在芳香族氨基酸和相关化合物在20°C，pH值7时的强度衰减吲哚色氨酸NATA酪氨酸O-甲基酪氨酸在溶液中的色氨酸侧链采用不同的构象，一个色氨酸溶液可以被视为一个的旋转异构体的混合物，即所谓的旋转异构体。在中性水溶液中，色氨酸两性离子形式时氨基被质子化（NH3+）和羧基电离（CO2–）。在溶液中的色氨酸能自淬灭，涉及吲哚环和带正电荷的铵基团。色氨酸也可以由氨基酸侧链淬火铵基淬火依赖于一定PH下色氨酸荧光量子产率随着pH从8提高到10的氨基发生解离，量子产量和平均寿命增加约三倍如何通过氨基淬火解释

色氨酸在pH值为7的双指数衰减？旋转异构体在淬火过程显示了比0.5纳秒短的衰减时间旋转异构体的存在可能是在中性pH值色氨酸的多指数衰减的主要的原因酪氨酸和色氨酸及其中性的结构类似物2.TIME-RESOLVEDINTENSITYDECAYSOF

TRYPTOPHANANDTYROSINE

色氨酸和酪氨酸的时间分辨强度衰变

过去不能够可靠地解决其衰减时间和幅度现在已知的0.5-和3.1-ns衰减组件显示不同的发射光谱2.1色氨酸的衰变相关的发射光谱假设一个样本显示多指数衰减，其衰减在不同的发射波长不同。然后描述的强度衰减中αi（λ）是与波长相关的指数前因素和τi的衰减时间。这个表达式假设衰减时间与波长无关。发射光谱由于每个组件可以计算的短期和长期ns色氨酸的衰减成分的光谱分辨率

2.2酪氨酸及其中性衍生物的强度衰变酪氨酸也可以显示复杂的衰变动力学，但其性质与色氨酸是相反的。酪氨酸及其中性类似物

N-乙酰基-L-酪氨酰胺的频域的强度衰减酪氨酸本身显示一个单指数衰变而NATyrA显示一个双指数衰变（可能是基态旋转异构体的存在）酪氨酸在水中的强度衰减通常是一个单一的指数3.INTENSITYANDANISOTROPYDECAYSOFPROTEINS

蛋白的强度和各向异性衰变由于NATA显示一个衰减时间，我们可以预期单色氨酸的蛋白质，显示单指数衰减。但是大多数单-色氨酸的蛋白质显示双重或三重指数衰减3.1单指数强度和核糖核酸酶T1的各向异性衰减最单一的色氨酸蛋白显示多指数衰减。然而，有有两个已知的例外天青蛋白、核糖核酸酶T1米曲霉。大多数的核糖核酸酶不包含色氨酸。核糖核酸酶T1，它包含一个不寻常的单一的色氨酸残基，一些条件下表现一个单指数衰减核糖核酸酶T1由

104个氨基酸组成的单链多肽

在2’-存在的核糖核酸酶T1结构GMP（2′-GMP删除）。59色氨酸位于α-螺旋和表之间的结构。核糖核酸酶T1有四个苯丙氨酸，九个酪氨酸，和一个单一的—色氨酸残基在位置59。色氨酸残基的活性位点附近。时间分辨荧光强度和各向异性

在缓冲水溶液的pH值5.5的核糖核酸酶T1衰减该衰变成为在pH7双指数。单指数衰变是方便的，因为变化的蛋白质结构可以被预期会导致更复杂的衰减动力学。检测出单指数衰变成为多指数衰减比检测在一个多指数衰减的变化简单一些3.2膜联蛋白V：钙离子敏感的单色氨酸蛋白质对于大多数的蛋白质，甚至与单色氨酸残基，强度和各向异性衰减更为复杂。一个例子是膜联蛋白V，它具有一个单一的色氨酸残基膜联蛋白是一类同源蛋白以钙依赖性方式结合到细胞膜上。在不存在钙时膜联蛋白V呈高度非指数的强度衰减钙会导致强度衰减变得更像一个单一的指数。表明了附近的淬灭基团在无钙的形式存在晶体膜联蛋白Ⅴ的结构是与该现象一致，因为在钙的存在下色氨酸残基移离蛋白质3.3有两个色氨酸蛋白质的各向异性衰减在多色氨酸残基的蛋白中，每个残基可以是刚性的或移动的。在相同的蛋白质色氨酸残基在不同的位置可以有不同的运动和各向异性衰变。时间分辨的单色氨酸的各向异性衰变的磷转运蛋白突变体。296nm激发4.ANISOTROPYDECAYSOFPROTEINS

蛋白的各向异性衰变前面我们看到的与蛋白质的研究基于色氨酸残基的数量有限色氨酸残基的数目增加时，它变得不切实际解决个别残基在这样的情况下，必须翔实的研究野生型蛋白质的寿命分布相移和解调的频率依赖性在学叶菌的β-葡萄糖苷酶的荧光发射因素

中性pH在5，45和85℃。在所指示的温度S.叶菌β-色氨糖苷酶寿命分布衰变是高度异质性，解释双峰寿命分布方面，随着温度的增加，这两个组逐步向更短的寿命迁移5.TIME-DEPENDENTSPECTRAL

RELAXATIONOFTRYPTOPHAN

色氨酸的光谱松弛时间在这一分析，我们假设每个色氨酸残基在所有的波长显示相同的寿命。然而，一个单一的色氨酸残基的寿命可能不是在所有的发射波长相同。吲哚甘油20°C的强度衰减不同的波长的发射光谱进行测量强度衰减强度衰减在310nm处，蓝色波长比在390纳米衰减得更迅速强度衰减在380nm处显示的上升时间是一个激发态过程的证明衰变相关光谱（顶部）和时间分辨发射谱（下）。DAS和TRES是从吲哚的甘油在20℃下相同时间分辨衰变计算出来衰变相关的光谱和时间分辨发射

从谱图，在30℃，289-nm激发髓鞘碱性蛋白6.PERSPECTIVESONPROTEINFLUORESCENCE

透视荧光蛋白大量的蛋白结构的可用性允许的蛋白质和它们的光谱特性的结构特征的相关性研究。如其中侧链是最有可能以猝灭色氨酸。能量转移从短到长波长色氨酸已经看到了几种蛋白质。发射最大值可以是与曝光相关溶剂，从蛋白质看去结构。荧光蛋白的更加深刻的理解将允许它的使用来回答更具体的问题关于蛋白质功能和蛋白质的相互作用与其他生物分子。多光子激发显微镜MultiphotonExcitationandMicroscopy多光子激发特点激发波长：两个或多个光子同时激发,激发波长是单光子激发波长的两倍或多倍多光子激发：依赖于多个光子同时到达的时间：使用脉冲飞秒激光器(i.e.10-16seconds),且能提供更高的峰值功率；荧光限制在焦点处，能满足多个光子同时达到产生多光子吸收。荧光强度正比于激光强度多光子激发---一个非线性过程多光子与单光子比较

单光子

双光子*照明锥体大体积激发

*激发局限在焦点