初级分离技术

生物分离工程初级分离技术总体学习目的和要求了解蛋白质表面特性，掌握各种沉淀和泡沫分离的原理、特点以及应用范围。目录引言沉淀分离蛋白质表面特性盐析沉淀等电点沉淀有机溶剂沉淀热沉淀其他沉淀法沉淀生成动力学泡沫分离引言－学习要点识记：初级分离概念理解：初级分离特点

初级分离概念初级分离是指从菌体发酵液、细胞培养液、胞内抽提液（细胞破碎液）及其他各种生物原料初步提取目标产物，使目标产物得到浓缩和初步分离的下游加工过程。

初级分离特点分离对象：体积大、杂质含量高；分离技术：低操作成本、适于大规模生产；分离方法：重力沉降、离心沉降、膜分离、萃取、吸附、沉淀分离及泡沫分离等沉淀分离－学习要点识记：盐析和盐溶概念理解：蛋白质凝集沉淀的屏障，各种沉淀方法的原理和影响因素应用：采用不同的试剂方法实现蛋白质的沉淀

沉淀的定义由于物理环境的变化而引起溶质溶解度的降低、生成固体凝聚物的现象，称为沉淀。

沉淀与结晶的区别沉淀生成的固体颗粒是不定形的结晶产品为单一组分，而沉淀凝聚物则成分非常复杂（除了目标产物外，还夹杂着多种共存的杂质、盐和溶剂等）沉淀的纯度远低于结晶多步沉淀操作也可获得高纯度的目标产品沉淀技术适用范围

沉淀分离在生物分离过程中应用相当广泛。一般情况下，沉淀分离方法在生物下游加工过程中通常作为初级分离技术加以使用，但在实际过程中也有仅通过沉淀分离得到目标产品的工业实例。是传统的分离技术之一，目前广泛用于实验室和工业规模蛋白质的回收、浓缩和纯化。蛋白质表面特性－蛋白质组成蛋白质组成20种氨基酸构成的两性高分子电解质，包括疏水性氨基酸和亲水性氨基酸蛋白质折叠趋势疏水性氨基酸：向内部折叠的趋势亲水性氨基酸：分布于蛋白质外表面的趋势

结果

在蛋白质三维结构中仍会有部分疏水性氨基酸残基暴露于表面，在蛋白质表面形成一定的疏水区

胶体的定义胶体是一种尺寸在1～100nm以至1000nm的分散体。它既非大块固体，又不是分子分散的液体，而是具有两相的微不均匀分散体系。

-《被遗忘了尺寸的世界》WilhelmFriedrichOstwald(1853–1932)胶体的性质比表面增大，界面现象重要

强烈的尺寸效应丁达尔现象布朗运动电泳现象蛋白质表面特性－蛋白质性质蛋白质的胶体性质

蛋白质的分子量约6～1000kDa，分子直径约为1~30nm。在此粒径范围内，蛋白质可视为胶体，并表现出胶体溶液的部分性质蛋白质的两性电离和等电点

蛋白质两端及侧链中有一些解离基，解离程度受pH影响。蛋白质的变性

物理因素：加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射、超声波的作用等；化学因素：有强酸、强碱、尿素、重金属盐、SDS等。

蛋白质表面特性－沉淀屏障蛋白质分子周围的水化层水溶液中蛋白质可视为胶粒，其周围存在着稳定的水化层，胶粒外的这部分水客观上起排斥作用，称为“水化层斥力”分子间的静电排斥作用根据扩散双电层理论，胶粒是带电的，其表面吸附相反电荷的反离子，这些位于胶粒周围过量的反离子好像胶粒四周为离子氛所包围。当两个胶粒（蛋白质）趋近而使离子氛发生重叠时，处于重叠区内的反离子浓度较大，从而破坏了原有电荷的对称性，引起离子氛中电荷重新分布，即离子从浓度较大的重叠区向未重叠区扩散。这种扩散的结果就是胶粒受到斥力而相互脱离。分子间的静电排斥作用发酵液是一种胶体溶液，胶体粒子（发酵液中菌体或细胞）表面一般带有负电荷，由于静电引力的作用，使它周围吸附一些带相反电荷的粒子（即正电荷），于是形成双电层。双电层的负电层在质粒上不动，而正电荷受溶液热运动的影响，具有离开胶粒表面的趋势，于是双电层就分裂成两部分：吸附层（紧密层）和扩散层，它们之间的界面称为Stern界面。在扩散层边缘有一滑动面，在面内的液体会随临近胶体的相对运动而一起移动，面外液体不随胶体运动。在不同界面会形成不同的电位。胶体表面电位为φs，Stern平面上电位为φd，滑动面上电位为ξ（能实际测得，所以它是表征双电层特性的重要参数）。ξ电位越大，胶粒间电排斥作用就越强，胶粒的分散程度也越大。

ξ电位与扩散层厚度和电动电荷密度（滑动面上电荷密度）成正比，而扩散层厚度又与溶液性质（电解质的种类，浓度，pH值等）有关，例如，对带负电性菌体的发酵液，高价阳离子的存在，可压缩扩散层的厚度，促使ξ电位迅速降低，而且化合价越高，这种影响越大。当双电层的排斥力不足以抗衡胶粒间的范德华力时，由于热运动的结果导致胶粒的互相碰撞而聚集起来。所以，要实现蛋白质沉淀，可以采用降低蛋白质周围水化层和双电层厚度的方法来降低蛋白质溶液的稳定性。而水化层厚度及ζ电位与溶液性质（电解质种类，浓度计pH值等）密切相关，所以，蛋白质的沉淀可采用恒温条件下添加各种不同试剂的方法实现。蛋白质表面特性

－沉淀策略及方法策略破坏蛋白质四周水化层降低双电层厚度

沉淀方法

改变溶液pH值

加入无机盐或改变无机盐种类加入水溶性有机溶剂添加脱水剂蛋白质表面特性

－常用的沉淀技术盐析沉淀等电点沉淀有机溶剂沉淀聚合物沉淀热沉淀盐析沉淀-学习要点识记：盐析和盐溶概念

理解：盐析沉淀的原理，影响盐析的各种因素

应用：掌握盐析操作过程

盐析沉淀-盐析的定义定义

蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象称为盐析（Salting-out）溶解度与I的关系－Cohn方程

盐析沉淀-盐析原理低离子强度下的盐溶

向蛋白质的纯水溶液中加入电解质后，蛋白质将吸附盐离子，而形成扩散双电层（产生分子间相互排斥作用）导致蛋白质的溶解度增大，发生盐溶高离子强度下的盐析溶液主体中那些与扩散层的离子电荷符号相同的电解质离子将把反离子压入（排斥）到双电层中，由于盐的水化作用，其将争夺蛋白质水化层中的水分子，使蛋白质表面疏水区脱水而暴露，增大它们之间的疏水性作用，容易发生凝聚，进而沉淀。盐析沉淀-盐析原理图示盐析沉淀-影响盐析因素蛋白质的分子量和结构

无机盐种类和浓度

相同离子强度下，不同种类的盐对蛋白质的盐析效果不同，即盐的种类将影响到Cohn方程中的盐析常数盐的种类对蛋白质溶解度的影响与离子的感胶离子序列相符盐析沉淀-无机盐的选择溶解度大，可配制成具有较高离子强度的无机盐溶液。溶解度受温度的影响较小。盐溶液密度不高，以便蛋白质沉淀的沉降或离心分离。硫酸铵是常用的盐析剂。温度和pH值

在低离子强度溶液中，蛋白质的溶解度在一定的温度范围内随着温度升高而增大在高离子强度溶液中，温度的升高利于蛋白质脱水，破坏水化层并导致蛋白质溶解度的降低

在pH值接近蛋白质的等电点的溶液中，蛋白质的溶解度最小。

因此，蛋白质的盐析沉淀操作需选择合适的pH值和温度，使蛋白质的溶解度最小。同时保证盐析操作条件要温和，不能引起目标蛋白质的变性。盐析操作-沉淀剂性质

对于用于沉淀剂的无机盐试剂，了解其性质，特别是无机盐的溶解性质（溶液密度、饱和浓度等），是必需的。以硫酸铵为例：20℃下，饱和浓度为4.05mol/L（相当于534g/L）

饱和密度为1.235kg/L；0℃下，饱和浓度为3.825mol/L（相当于505g/L）

盐析操作-溶解度曲线确定离心分离沉淀物并重新溶解测定其中总蛋白和目标蛋白的浓度以饱和度为横坐标，上清液中总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标，得到蛋白质溶解度曲线Typicalammoniumsulphateprecipitationrangesforproteinsfromacrudeextractinsupernatant.(●)EGFPrelativecontentinsupernatant,(■)totalproteinrelativecontentinsupernatant

NormalizedeGFPcontentintheprecipitatedpelletatdifferentsaturationofammoniumsulfate盐析操作-无机盐加入量硫酸铵的摩尔浓度由M1增大到M2所需要加入的硫酸铵质量W为

20℃0℃如果用饱和度S代替摩尔浓度M，等电点沉淀-学习要点理解：等电点沉淀法原理应用：了解等电点沉淀法的优缺点和适用范围等电点沉淀-定义利用蛋白质在pH值等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀分级的方法称为等电点沉淀法

等电点沉淀原理利用在低离子强度下蛋白质溶解度较低的特性，调整溶液pH值至等电点或在等电点的pH下利用透析等方法降低离子强度，使蛋白质沉淀。等电点沉淀-沉淀条件较低的溶液离子强度溶液的pH值接近等电点等电点沉淀-实现方式在低离子强度下调整溶液pH值至等电点在等电点的pH值下利用透析等方法降低溶液的离子强度，使蛋白质沉淀

等电点沉淀-操作特点等电点沉淀在较低的离子强度下进行，因此沉淀操作结束后无需脱盐

与其它沉淀结合使用，例如在等电点附近进行的盐析沉淀操作时可以获得更小的蛋白质溶解度

溶液的pH值调节方便，但过低的蛋白质等电点容易引起目标蛋白质变性有机溶剂沉淀-学习要点理解：有机溶剂沉淀法原理应用：了解有机溶剂沉淀法的优缺点和适用范围有机溶剂沉淀-原理向蛋白质溶液中加入水溶性有机溶剂：水的活度将降低有机溶剂对水具有很大的亲和力，能够争夺蛋白质表面的水分子。结果：随有机溶剂浓度增大，水化程度降低，溶液的介电常数下降，蛋白质分子间的静电引力增大，从而发生凝聚和沉淀

有机溶剂沉淀-原理图示有机溶剂沉淀-特点优点有机溶剂密度较低，易于沉淀分离

与盐析沉淀相比，沉淀产物不需脱盐

缺点有机溶剂沉淀容易引起蛋白质变性常用的有机溶剂沉析剂选择依据：不会对蛋白产生变性；溶解度高；介电系数小；毒性小，容易回收乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广；特点：介电常数小，60%乙醇的介电常数是48 丙酮的介电常数是22容易获取影响因素及控制A、[乙醇]：通常随[乙醇]上升，protein溶解度下降。过多加入乙醇也可能导致样品变性。B、[pro]：避免使用很稀的浓度，以免使用大量乙醇。一般认为，对于蛋白质溶液0.5%～2%起始浓度较合适,对于粘多糖以1%～2%为起始浓度为宜C、T：当乙醇与水混合时，会放出大量的稀释热，使溶液T显著升高，对不耐热的pro影响较大。解决办法：搅拌、少量多次加入，以避免温度骤然升高损失pro活力。另一方面温度还会影响有机溶剂对pro的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全。但太低温度杂蛋白可能过多。D、pH值：在确定了[乙醇]以后，pro最低溶解度出现在蛋白的pI处，因此可以通过调节pH值来选择性分离蛋白质。E、加入金属离子（相当于结合了金属离子沉淀，不过介电系数降低有利于金属离子结合到蛋白成盐而沉淀）有机溶剂沉淀法操作注意事项选择性变性沉淀法利用蛋白质、酶、核酸等生物大分子对某种物理或化学因素的敏感性差异，实现分离。加入变性剂选择性热变性选择性酸碱变性使用时需慎重，目标蛋白很稳定时方可用！蛋白变性后沉淀：蛋白分子变性后，蛋白分子内疏水键打开，与其它分子疏水键形成新的疏水键，从而形成分子量更大的复合大分子要区别凝絮和变性沉淀区别，凝絮过程中也有大分子复合物产生，主要是凝絮剂起架桥作用把蛋白集合在一起（如聚电解质沉淀法，聚阳离子壳聚糖作废水澄清剂法，都是凝絮法）热沉淀-学习要点理解：了解热沉淀原理

热沉淀-原理在较高的温度下，热稳定性差的蛋白质将发生变性，有规则的肽链结构被打开呈松散状不规则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴露，进而发生凝聚和沉淀，利用这一现象，可根据蛋白质间的热稳定性的差别进行蛋白质的热沉淀，以分离出热稳定性高的目标蛋白产物

该过程与热力学沉淀方法不同，热沉淀过程是基于蛋白质的变性动力学其他沉淀技术聚合物沉淀

非离子型聚合物沉淀聚电解质沉淀

重金属盐沉淀蛋白质

生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质机理：聚乙二醇(PEG)分子利用其庞大的体积和分支，从溶剂排斥蛋白质，导致蛋白结合；剥离蛋白水合膜；聚合物与被分离物质共沉；被分离物质在水相和聚合物间分配；被分离物与聚合物形成复合物。优点：1.室温2.颗粒大，易于收集3.提高蛋白质的稳定性4.生物相容性好缺点：PEG溶液相难和蛋白样品分离（DEAE-纤维素吸附蛋白，而PEG不吸附）；且粘度高；价格贵非离子型聚合物沉淀机理：架桥；剥离蛋白表面水膜；电中和效应常用材料：聚丙烯酸（pH2.890%蛋白沉淀）聚甲基丙烯酸聚乙烯亚胺聚苯乙烯季胺盐（pH10.4,95%蛋白沉淀）聚电解质沉淀原理：金属离子的沉淀作用是由于它们能与蛋白质分子中的特殊部位起反应造成的。例如锌易与组胺酸残基中咪唑基结合，使蛋白质的等电点转移，从而降低蛋白质的溶解度。也有金属离子能氧化巯基，形成蛋白分子通过巯基聚集而形成沉淀。有些过渡态金属由于可接受成对电子，有多个配位部位可起到蛋白分子间（特别是变性分子间）搭桥，形成网络状盐结构，而聚集蛋白形成沉淀。特点：有时候产生变性（在沉淀过程中）需要分离去金属离子，特别是重金属重金属盐（金属离子）沉淀一般可分三类：①能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的一些金属离子，如：Mn2+、Fe2+、Ｃo2+、Ni2+、Ｃu2+、Zn2+、Cd2+;②能与羧酸结合而不与含氮化合物结合的一些金属离子，如：Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+;③能巯基化合物强烈结合的一些金属离子，如：Ｈg2+、Ag2+、Pb2+。实际应用时，金属离子的浓度常为0.02mol/L。复合物中金属离子的去除，可用离子交换法或EDTA金属螯合剂。生物碱是植物中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质，凡能使生物碱沉淀，或能与生物碱作用产生颜色反应的物质，称为生物碱试剂。如鞣酸、苦味酸和磷钨酸等。当蛋白质溶液pH值低于其等电点时，蛋白质为阳离子，能与生物碱试剂的阴离子结合形成盐而沉淀。溶液中的蛋白亦能被有机酸沉淀，其中以三氯醋酸的作用最为灵敏而且特异，因此，广泛的用于蛋白质的沉淀。生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质沉淀生成动力学-沉淀生长

异向生长

发生在沉淀生成初期，微细的蛋白质颗粒为布朗粒子，沉淀生长为扩散速率控制同向凝聚

较大的沉淀颗粒在搅拌剪切作用下通过碰撞而进一步凝聚，生成大颗粒沉淀溶解度是一个平衡特性，但是溶解度值的降低是一个动力学过程。当体系变得不稳定以后，分子互相碰撞并产生聚集作用。通常认为相互碰撞由下面几种运动引起：①热运动，Bromnian运动；（二级生长动力学）②对流运动，由机械搅拌产生；③差示沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。前两种机理在蛋白质沉淀中起主导作用，第③种机理在沉降过程中起主导作用(如在废水处理中)。

异向聚集：由Brownian运动（悬浮在液体或气体中的微小粒子所做的不停顿的无规则运动）所造成的碰撞导致。

同向聚集：而由对流运动所造成的碰撞导致。1.4沉淀生成动力学①热运动，Bromnian运动；布朗离子的扩散控制，发生异向聚集（二级生长动力学）②对流运动，由机械搅拌产生；对于大于1微米的离子，主要受液体剪切作用，颗粒间相互碰撞，发生同向聚集。（二级生长动力学）具体速度系数泡沫分离识记：泡沫分离的概念理解：泡沫分离的原理、优势应用：泡沫分离的应用泡沫分离概念泡沫分离是根据表面吸附原理，利用通气鼓泡在液相中形成的气泡作为载体对液相中的溶质或颗粒进行分离的方法。又称为泡沫吸附分离。该分离过程必须要在表面活性物质存在的条件下才能发生。例如：日常生活中的各种洗涤作用就是依据泡沫分离的原理。泡沫分离技术是近十几年发展起来的新型分离技术之一。泡沫分离是根据吸附的原理，向含表面活性物质的液体中鼓泡，使液体内的表面活性物质聚集在气液界面（气泡的表面）上，在液体主体上方形成泡沫层，将泡沫层和液相主体分开，就可以达到浓缩表面活性物质（在泡沫层）和净化液相主体的目的。被浓缩的物质可以是表面活性物质，也可以是能与表面活性物质相络合的物质，但它们必须具备和某一类型的表面活性物质能够络合或鳌合的能力。人们通常把凡是利用气体在溶液中鼓泡，以达到分离或浓缩目的的这类方法总称为泡沫吸附分离技术，简称泡沫分离技术。泡沫分离原理泡沫分离(FoamSeparation)又称泡沫吸附分离(FoamSeparationAdsorbent)技术，早在1915年就开始应用于矿物浮选20世纪50年代末首先是从溶液中回收金属离子的课题开始，前期研究了泡沫分离金属离子的可行性20世纪60年代中期采用泡沫分离法脱除洗涤剂工厂排放的一级污水和二级污水中的表面活性剂——直链烷基磺酸盐和苯磺酸盐获得成功1977年泡沫分离DNA、蛋白质及液体卵磷脂等生物活性物质分离原理表面活性：物质颗粒在两相界面上时，由于受力不均匀，因此需要额外能量维持运动稳定，这种能量就称为表面自由能。加入表面活性剂（一般为两亲分子），可占据两相界面，排挤物质颗粒，从而减少表面自由能，使体系稳定，属于自发过程。不同表面活性剂在界面吸附能力不同，根据这点可直接用于生物表面活性物质，如蛋白，核酸的分离。泡沫分离过程是利用待分离物质本身具有表面活性(如表面活性剂)或能与表面活性剂通过化学的、物理的力结合在一起(如金属离子、有机化合物、蛋白质和酶等)，在鼓泡塔中被吸附在气泡表面，得以富集从底部通入大量气泡溶质吸附在气泡上并随之上升泡沫层它的分离作用主要取决于组分在气－液界面上吸附的选择性和程度，其本质是各种物质在溶液中表面活性的差异Γ为吸附溶质的表面过剩量，即单位面积上吸附溶质的摩尔数与主体溶液浓度之差,对于稀溶液即为溶质的表面浓度，可通过σ(溶液的表面张力)与浓度c(溶质在主体溶液中的平衡浓度)来求得；Γ/c为吸附分配因子。溶液中表面活性剂浓度c和表面过剩量Γ的相互关系可用右图表示。在b点之前，随着溶液中表面活性剂浓度c增加，Γ成直线增加：Γ=Kc

b点后溶液饱和，多余的表面活性剂分子开始在溶液内部形成“胶束”，b点的浓度称为临界浓度(CMC)，此值一般为0.01～0.02mol/L左右，分离最好在低于CMC下进行。泡沫分离设备和操作泡沫的形成首先在液体内部形成被包裹的气泡。在此瞬时，溶液中表面活性剂分子立即在气泡表面排成单分子膜，亲油基指向气泡内部，亲水基指向溶液该气泡会借浮力上升冲击溶液表面的单分子膜。在某种情况下，气泡也可从表面跳出。此时，在该气泡表面的水膜外层上，形成与上述单分子膜的分子排